此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
把切下来的胶按试剂盒说明书操作即可。 几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。
第四天半天即可，下午开始
前一日消毒物品：1ml、200ul、20ul枪头、15ml离心管、1.5ml EP管100ml LB液体培养基、200ml LB固体培养基【切记！！消毒完后立即放入65℃烤箱内，LB培养基瓶口用锡箔纸包住后再用包布包住】 TRYPTONE 1g
LB液体培养基 Yeast Extract 0.5g 双蒸水定容至100ml
Nacl 1g
TRYPTONE 2g
LB固体培养基 Yeast Extract 1g 双蒸水定容至200ml
Nacl 2g 可以倒8块板子
Agar 3g
准备物品：拿培养皿，照台子，LB固体培养基倒板子【切记！！倒之前待200ml LB固体培养基冷却至37℃时加入200ul AMP，倒的过程中不要挪动皿，不用的板子封口膜封住4℃倒置放】、打冰放入4℃冰箱
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、白斑筛选
1：连接T载体 参照试剂盒
（1） T—Vector PMD19（simple） 1ul【已分装好，将PCR产物直接加进去】 回收的PCR产物 4ul
（2）将上述5ul溶液加入到5ul solution【已分装好】里面，充分混匀。 （3）PCR仪里面16℃孵育30分钟—1小时。
（4）将上述10ul反应溶液加入含有100ul感受态细胞的1.5mlEP管内【切记！！感受态细胞不能离心,感受态细胞要放在冰上】，轻弹管壁混匀，冰浴30min【提前打好冰放4℃冰箱】。 （5）42℃热休克45second【接杯水用温度计调整温度为42℃】，然后迅速放到冰上冰浴1min。 （6）加入不含AMP的LB液体培养基890ul【切记！！不含AMP】，水平放置EP管，37℃摇床，200转，摇1小时。
（7）将EP管拿出离心2000rpm【转速要准确】，1min，超净台内稍微去上清，留100—150ul。 （8）涂板：涂板后先正置30min【防止液体倒流】，再将板子倒置37度细菌培养箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）涂板过程中要注意用酒精消毒，防止细菌交叉污染！
第五天上午
（1）过夜后可见板上长出很多白色斑点，用20ul枪头挑取单个的白色斑点放于15ml离心管内【离心管内装有5-6ml 的！！加入AMP 的LB液体培养基】，离心管的盖子不能盖紧【保证氧气进入】！
（2）将15ml离心管斜放入杯子内37度，200转，摇床过夜。
第六天一整天
（1）早上看到菌液浑浊后，吸取2ul菌液行PCR跑胶鉴定，剩余的菌液盖子拧紧4℃保存
【防止细菌长老了】。如果当天不能测序的话可以等到晚上取100ul菌液再次摇过夜第二日送检。
（2）联系测序公司送测序。 这一部分的细节：
不要让白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。 注意事项：
1. 整个操作中不要有剧烈的振荡（也就是在加入各种液体混匀的过程中）。因为经过氢氧
化钠处理后的DNA相对比较脆弱，剧烈的振荡（vortex）可能会造成DNA的断裂，如果是发生在目的片段内部，也就造成了模板的减少，给PCR带来不良影响。
2. 另外就是糖原的量。在我的操作中为了使C==》T的转化比较彻底，我加大了整个反应
体系（也就是用传统的样品量，但是各种试剂均加倍，这样也便于操作，每步丢失的东西也相对较少），这样在最后回收的时候糖原的作用就尤其的重要了。具体加多少要看大家各自的体系了。我是0.7ml的体系中加了24微克糖原，在-20度存放了30min后，12，000rpm，10min离心，最后收取的DNA行PCR，效果还可以。
1DNA的量比较少；○2DNA的量不3. 乙醇沉淀看不到沉淀的原因主要有以下几种可能：○
是很少，但是很纯，也很难看到（有就是说有蛋白质什么的一些异物的时候倒是比较容
3没有沉淀下来。 易看到沉淀，所以如果一下子就看到沉淀了未必是好事）；○
4. 在做bisulfite sequencing中，在沉淀的时候一定要加糖原，效果很好的。一般加了糖原
之后是可以看到沉淀的。糖原要在加了醋酸钠以后，加入乙醇（或异丙醇）之前加入的。 5. 其实经bisulfite处理之后的DNA也没有脆弱到那种马上就消失的地步。只是在处理的
过程中，一定要注意轻柔，不要让你的人马在半路都消耗于非战斗性损伤——单链的DNA（也就是氢氧化钠处理之后的DNA）还是很容易受伤的，剧烈的振荡足以使之殒命。