i. 建立基因组索引文件 (约1min)
命令行： cd cd RNA-seq bowtie2-build data/GRCh37chr21.fa chr21 运行完后，在当前目录[RNA-seq目录]下进行查看，可看到生成以下结果文件：
参数说明：GRCh37chr21.fa 是基因组文件， chr21是基因组索引文件的前缀名称。 结果文件说明：
chr21.1.bt2; chr21.2.bt2; chr21.3.bt2; chr21.4.bt2; chr21.rev.1.bt2; chr21.rev.1.bt2; 是建立的索引文件，共6个。
ii. 用tophat进行基因组比对 (约12min/file)
命令行：
cd ~/RNA-seq/ 运行完后，在当前目录[RNA-seq目录]下生成文件夹C460_mapping 和P460_mapping。 tophat -p 1 -G data/genes.gtf -o C460_mapping chr21 data/C460-R1.fq data/C460-R2.fq tophat -p 1 -G data/genes.gtf -o P460_mapping chr21 data/P460-R1.fq data/P460-R2.fq 如进入C460_mapping，可以看到如下结果:
参数说明：-p 1 表示使用一个线程；-G genes.gtf表示使用已知基因结构注释文件，在比对中，bowtie会优先对这部分进行比对；-o 表示生成文件夹的名称; 其他参数全都使用默认参数。
结果文件说明：accepted_hits.bam表示比对上的reads生成的比对文件，unmapped.bam表
示没有比对上的reads生成的比对文件；这两个文件都可以用samtools工具进行查看[samtools view –h accepted_hits.bam|head -10]; deletions.bedinsertions.bedjunctions.bed是tophat对可变剪接位点的记录文件，分别表示没有检测到的可变剪接位点；识别出的剪接位点和所有已知未知的可变剪接位点,可以用less进行查看[ less junctions.bed|head -10 ]; align_summary.txt 是tophat2.0.09版本及以上对reads比对情况的统计；pre_reads.info和logs文件是对进程中的reads数目和进程运行情况的记录。
iii. 生成比对文件的索引文件(约1min)[可视化部分使用]
命令行：
cd ~/RNA-seq/ samtools index C460_mapping/accepted_hits.bam samtools index P460_mapping/accepted_hits.bam
运行完后，在当前目录[RNA-seq目录]的C460_mapping和P460_mapping文件夹下，分别生成文件.bam.bai。
如进入C460_mapping，可以看到如下结果,生成了文件accepted_hits.bam.bai:
4. 表达量估算 (约1min/file)
在表达量估算部分，我们使用cufflinks工具，先对短片段reads进行转录本重构，然后计算基因和转录本的表达量，以FPKM为单位。
命令行：
cd ~/RNA-seq/ cufflinks -p 1 -G data/genes.gtf -o C460_expression C460_mapping/accepted_hits.bam cufflinks -p 1 -G data/genes.gtf -o P460_expression P460_mapping/accepted_hits.bam
运行完后，在当前目录[RNA-seq目录]下，生成文件夹C460_expression和P460_expression。
如进入C460_expression文件夹，可以看到如下结果:
参数说明：-p 1 表示使用一个线程；-G genes.gtf表示使用已知基因结构注释文件，对这些有结构注视的基因和转录本进行表达量估算；-o 表示生成的文件夹名称。
结果文件说明：genes.fpkm_tracking是生成的基因表达量的文件；isoforms.fpkm_tracking是生成的转录本表达量的文件；transcripts.gtf, skipped.gtf分别表示检测了的基因结构文件和滤掉的基因结构文件。
5. 差异表达分析 (约2min)
在表达量差异分析部分，我们使用edgeR软件包进行分析。extractExpr和DGE是独立编写的分析脚本。 命令行： cd ~/RNA-seq/ extractExprdata/genes.gtf C460_expression/isoforms.fpkm_tracking 运行完后，在当前目录[RNA-seq目录]下，生成文件夹C460-vs-P460。 P460_expression/isoforms.fpkm_tracking DGE -d expression.xls -g1 C460 -g2 P460 -o differential 可看到生成如下结果：
参数说明：-p 1 表示使用一个线程; -o 表示生成的文件夹名称; genes.gtf是cuffdiff进行差异分析的必需基因结构文件。
结果文件说明：分别产生了cds, gene, isoform,tss的四套差异表达结果，.diff表示差异结果的文件；fpkm_tracking表示表达量估算的文件；count_tracking表示表达量计数的文件。
6. 使用DAVID数据库进行功能搜索
DAVID是一个免费数据库，并提供基因功能搜索，分析和展示的功能，可以分析多种格式，不同物种的基因数据（http://david.abcc.ncifcrf.gov）。按照网址访问DAVID网站，在Start Analysis标签下输入基因编号的列表，选择对应的编号格式，提交即可完成相关搜索和分析。
四、 补充：软件安装和使用环境设置
在计算过程中，常需要自己安装软件。在这补充部分中，主要是关于bowtie,tophat,cufflinks软件的安装和使用环境设置。
首先，分别在bowtie官网[http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml]；tophat官网[http://tophat.cbcb.umd.edu/]；cufflinks官网[http://cufflinks.cbcb.umd.edu/]下载对应的软件，例如：unzip bowtie2-2.1.0-linux-x86_64.zip；tophat-2.0.10.Linux_x86_64.tar.gz；cufflinks-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz等软件。
之后，上传软件到服务器，解压文件，把路径导入到环境中，如在RNA-seq目录下，新建bin文件夹，把软件上传到bin文件夹下：
命令行：
cd RNA-seq||mkdirRNA-seq;cd RNA-seq;mkdir bin;cd bin #在RNA-seq下建立文件夹bin #使用filezilla把软件上传到RNA-seq/bin目录下 unzip bowtie2-2.1.0-linux-x86_64.zip export PATH=$HOME/RNA-seq/bin/bowtie2-2.1.0:$PATH tarxvzf tophat-2.0.10.Linux_x86_64.tar.gz export PATH=$HOME/RNA-seq/bin/tophat-2.0.10.Linux_x86_64:$PATH tarxvzf cufflinks-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz export PATH=$HOME/RNA-seq/bin/cufflinks-2.1.1.Linux_x86_64:$PATH 版本核查：
可以看到，环境中的bowtie2版本是2.1.0, tophat版本是2.0.10, cufflinks是2.1.1，正是我们安装的软件。