细菌分类学课件 菌株（strain)，从自然界分离得到的任何一种微生物的纯第一章 绪论 培养物都可以称为微生物的一个菌株
细菌分类学是研究细菌分类理论和方法的科学，它包括居群（population)是指一定空间中同种个体的组合 （分类、命名、和鉴定)3个独立和相关的分类学领域。 型（form或type)：常指亚种以下的细分，当同种或同亚细菌分类的目的？课本第一页 种不同菌株之间的性状差异，不足以分为心的亚种时，可
第一节 细菌分类学的发展和趋势 以细分为不同的型 。
细菌分类学的发展： 生物型 biovar biotype 特殊的生理生化性状的菌株群 一、形态学时期：分类依据：细菌的形态特征 血清型 serovar serotype 不同的抗原特征的菌株群 1872年，德国植物学家Cohn提出第一个细菌分类系统。致病型 pathovar pathotype 对宿主致病性的差异的菌株将细菌分为球菌、短杆菌、长杆菌和螺旋菌 二、生理学时期(第二纪元) 分类依据：生理特征为主 起始于：Orla-Jesen(1909年)的分类系统 主要贡献：1916-1918年，美国微生物学家Buchanan对细菌的命名和分类进行了研究，把细菌分成科、族和属。 1957年，英国细菌学家Sneath把电子计算机技术应用于细菌分类，建立数值分类法。 三、分子生物学时期(第三纪元) 分类依据：化学结构和核酸 起始于：20世纪60年代 应用： 1、分子生物学技术在细菌分类中的应用： 一、DNA分子中G＋C百分含量测定：亲缘关系越近的细菌，G+Cmol%越相近 二、DNA-DNA杂交 三、16S rRNA相关度分析 2、分子生物学技术在细菌鉴定中的应用： 一、核酸探针：原理：用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段(探针)，在一定条件下，按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小 二、核酸扩增技术 3、分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用： 检测耐药基因 第二节 细菌的分类单元和命名规则 一、分类单元及其等级：分类单元：是指具体的分类群。和 其他生物分类一样，细菌的分类单元也分为七个基本的分类等级或分类阶元，由上而下依次是界、门、纲、目、科、属、种。 1、种的概念：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别。 2、亚种：当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性而又不足以区分成新种时，可以将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元—亚种。 亚种是细菌分类中具有正式分类地位的最低等级。 3、亚种以下的等级：生物型、培养型、致病型、血清型、噬菌型、化学型、形态型等。 在细菌分类中，还常常使用非正式的类群术语。如培养物、菌株、居群和型 培养物（culture),是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物 群 噬菌型 phagovar phagotype lysotype 对噬菌体有特异性反应的菌株群 形态型morphovar morphotype 特殊的形态学特征的菌株群
4、属：是介于种（或亚种）与科之间分类等级，也是生物分类中的基本分类单元。通常把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个高一级的分类单元，称之为属。 5、科：把具有某些共同特征或相关的属归为更高一级的分类单元称为科。 二、细菌分类单元的命名规则 (一)国际细菌命名法规 1、分类单元的命名法 (1)属名 用一个单数主格名词或当作名词用的形容词来表示，可以是阳性、阴性或中性，首字母要大写。 如：Bacillus(芽胞杆菌属)(阳性) Lostridium(梭菌属)(中性) Salmonella(沙门氏菌)(阴性) (2)种名 双名法命名 由属名和种名两部分组合而成。第一个词为属名，首字母要大写；第二个词为种名词，常用形容词，也可以用人名、 地名、病名或其他名词 ( 名词用主格或所属格形式 )，种名加词首字母不大写。例： Pseudomonas aeruginosa( 铜绿色假单胞菌) Mycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌) Bacillus thuringiensis(苏云金
芽胞杆菌)
(3)亚种名 由属名、种名加词和亚种名加词构成 如：Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans (反硝化产碱杆菌氧化木糖亚种) (4)属以上分类单元的名称，是用拉丁或其他词源拉丁化的复数名词(或当作名词用的形容词)命名，首字母要大写 2、新名称的合格发表 3、合法性 4、发表的优先权 5、有效发表 (二)细菌名称的批准名录 第三节 细菌的分类系统 一、克拉西里尼科夫分类系统 二、普雷沃分类系统 三、伯杰氏分类系统(当前国际上普遍采用) (一)第七版系统(1957年) (二)第八版系统(1974年) (三)伯杰氏系统细菌学手册(1984-1989年) (四)<<伯杰细菌鉴定手册>>第九版(1994年) 1、具有细胞壁的革兰氏阴性细菌
2、具有细胞壁的革兰氏阳性细菌
3、无细胞壁的细菌 4、古细菌
第四节 细菌在生物界中的分类地位及其系统发育研究 1987年，Woese根据rRNA序列分析结果，提出生物分类的新建议，将生物分为真细菌、古细菌和真核生物三个领域
细菌的12个类群
1、紫色光合细菌及其有关细菌现在称为变形细菌（the 作为测量它们大小的单位.内眼的最小分辩率为0.2mm,观察细菌要用光学显微镜放大几百倍到上千倍才能看到。 观察方法：显微镜检查----普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 电子显微镜 暗示野显微镜 的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
Proteobacteria） 2、绿硫细菌 3、无硫绿细菌 4、蓝细菌
5、浮霉状菌属(Planctomyces)-小梨形菌属（Pirella） 6、螺旋体
7、拟杆菌属(Bacteroides)-黄杆菌属（Flavobacterium） 8、衣原体（Chlamydia）
9、异常球菌属(Deinococcus)-栖热菌属(Thermus) 10、革兰氏阳性细菌
11、栖热袍菌属(Thermotoga)-栖热腔菌属(Thermosipho) 12、产液菌属(Aquifex)-氢杆菌(Hydrogenobacter) 二、古细菌
A细胞具有完整细胞壁????.
B利用小分子有机物或无机物生成甲烷?..产甲烷菌 BB不利用????????????. C极端嗜盐，生长要求至少1.5mol/LNaCl??极端嗜盐古菌
CC不嗜盐生长
D最适生长温度高达105,嗜热代谢元素硫??.极端嗜热和超嗜 热代谢元素硫的古菌
DD最适生长温度高达80-83，代谢元素硫和硫代硫酸盐?..还原硫酸盐古菌
AA不具有完整细胞壁?????.无细胞壁古菌(热原体属)
什么是古细菌？ 与真细菌区别：
一、生存环境：古细菌一般在极端环境(高盐、高温、强酸、强碱等)下生存。
二、细胞膜：古细菌膜脂由甘油醚组成真细菌膜脂由甘油脂组成
三、细胞壁：古细菌：不含胞壁酸，仅含蛋白质和多糖，至多还含“假胞壁质”。 四、古细菌的16S和5SrRNA的核苷酸排列顺序也明显有异于真细菌
五、对一些能够作用于真细菌的抗生素如：青霉素、头孢霉素、D-环丝氨酸、利福霉素、利链菌素、氯霉素不敏感 。
第二章 细菌的分类特征和细菌鉴定
第一节 细菌的分类特征
一、个体形态特征
1、个体大小:通常以微米(Micrometer,um;1um=1/1000mm)相差显微镜 由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 2、形状和排列 球菌：（Coccus） 单球菌：
双球菌（Diplococcus）：成对排列 例：肺炎双球菌(肺炎链球菌)
链球菌（Streptococcus）：成链条状 例：乳链球菌 四联球菌（Micrococcus tetragenus）：四个叠在一起成田字形 例：四联微球菌 八叠球菌（Sarcina）：八个叠成立方体 例：甲烷八叠球菌
葡萄球菌（Staphylococcus）：不规则排成一串 例： 杆菌（Bacillus）：
弧菌（Vibrio）菌体只有一个弯曲，呈弧状或逗点状。如霍乱弧菌。
螺菌（Spirillum）菌体有数个弯曲。如鼠咬热螺菌、紫硫螺旋菌和红螺菌。
另外，在环境工程中，我们经常会遇到一种被称为丝状菌的形态，在水体、潮湿土壤及活性污泥中普遍存在，如球衣菌、发硫菌等。 所谓丝状菌，其实是由柱状或椭圆状的细菌细胞一个一个连接而成的，外面有透明的硬质化的粘性物质包裹（称为鞘）。
所以它实际上是一种细菌的群体形态，故从严格意义上来说，是不应把它列为细菌的个体形态的，但从实际应用的角度，这种分法也是具有价值的。 3、细胞结构 (1)鞭毛 (2)芽胞 (3)荚膜 (4)细胞壁 (5)纤毛 (6)细胞内含物：异染粒、伴胞晶体、硫粒、聚B-
羟丁酸等 甘油复红试验 (4)吲哚试验 细菌荚膜和负染色法 5、酶反应 (1)氧化酶试验 (2)接触酶试验 (3)凝固酶4、分生孢子的颜色、形状和表面饰物 试验 (4)DNA酶试验 (5)磷酸酶试验 5、染色反应：一、单染色法：一种染料 四、生态因子 生境 寄主 致病性 二、复染色法：用两种或两种以上染料：革兰染色、抗酸五、细胞组分 细胞壁成分 脂质成分 脂多染色 糖和胞外多糖 异戊二烯醌 细胞色素 酶 三、特殊染色法：鞭毛染色 异染颗粒染色 荚膜染色 六、血清反应 血清学分类就是依赖于细菌细胞组分具芽胞染色 有的抗原性和依据抗原抗体反应的专一性，区分细菌的不四、负染色法： 同类型。 五、荧光染色法： 细菌抗原依据其存在部位分为 ： 二、培养特征 细胞表面抗原(包括鞭毛、性纤毛、纤毛、菌体(一)接种与分离方法 1、平板划线分离培养2、倾注平表面蛋白、菌体外表多糖、外膜蛋白等) 板法3、穿刺接种法4、液体培养基接种法5、琼脂斜面内抗原(主要指细胞内的可溶性蛋白) 接种法 6、涂布接种法 (二)细菌的培养方法 1、需氧培养 2、二氧化碳培养 第二节 细菌鉴定 3、微需氧培养 4、厌氧培养 细菌鉴定的应用：动、植物检疫、食品卫生检验、人类及(三)细菌在培养基上生长特性 动、植物病原诊断、环境微生物学研究 1、固体培养基： (1)菌落的形态特征：菌落大小、形态、一、鉴定与分类的区别 1、目的不同 2、分类鉴定颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质的方案不同 3、分类鉴定的复杂程度不同 地、隆起形状、边缘特征及迁移性等 二、检索表 (2)菌落溶血特征：a溶血：草绿色环 B溶血：完全清晰1、双歧式检索表： 2、表格式检索表(鉴定特征表) 透明的溶血环 r溶血：菌落周围培养基无变化 三、鉴定的工作原则与步骤 (3)色素： 原则： 1、保证鉴定的分离物是纯培养 (4)气味 2、根据掌握的材料将分离物由一个大的归属范围逐步缩2、液体培养基：混浊、沉淀、表面生长形成菌膜 小到较小的或特殊的类群。 3、半固体培养基 穿刺接种观察运动、扩散情况。 3、根据可得到的一切信息，进一步缩小分离物的归属范三、生理生化反应 围到属、种。 1、能量代谢：化能有机营养型 化能无机营养型 4、尽量减少所使用的实验项目。 光能有机营养型 光能无机营养型 5、在鉴定中要有一个适当分类单元的标准菌株做对照，2、氧的需求 专性好氧 专性厌氧 兼性厌氧 微以证明本实验室采取 的实验条件是有效的。 好氧 步骤：常规的细菌检验方法是将临床采集的标本经过选择3、营养：碳、氮源利用谱是细菌分类与描述的一大类内性增菌(过夜)，选择性分离培养(过夜)，细菌生化鉴定(2～容。 3d)，血清凝集试验，最终鉴定出细菌。 (1)枸橼酸盐利用试验 (2)丙二酸盐利用试验 四、常规鉴定技术的发展 1、染色和显微技术方面 2、(3)醋酸钠利用试验 (4)乙酰胺利用试验 分离培养标准化、方便化 3、生理生化试验快速、微量化4、代谢产物 (1)甲基红试验(MR) (2)VP试验 (3)4、血清学 5、 动植物实验五、编码鉴定
原理：通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字(编码)，查阅检索本或数据库，得到细菌名称。
第三节 细菌快速鉴定中的分子生物学技术 的检测。
细菌快速鉴定：是指在对标本进行检测的过程中，通常无第四节 血清学快速鉴定方法 需进行细菌的分离纯化或常规试验，而是利用有关技术，一、免疫酶技术： 在几小时乃至几十分钟内从混杂样品中直接确定是否存原理：酶与抗原(抗体)结合，形成酶抗原(抗体)复合物，在某种活细菌、细菌产物或抗原成分的鉴定方法。 它既有免疫学活性，又有酶活性，在遇到相应底物时可催一、核酸探针技术 化底物水解、氧化或还原反应，从而生成可溶性或不可溶原理：核酸探针是带有标记物的已知序列的核酸片断，它性的有色物质，或者发光。 能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，可用于待测核酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及半乳糖苷酶等 酸样品中特定基因序列的检测。 固相载体：纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻标记物：酶、化学荧光物、放射性核素或生物素。 璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。可以各种形式出现: 试管、杂交方法： 微量反应板凹孔、小珠等。最常用的聚苯乙烯板（96孔菌落原位杂交：1、将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上 板），其对蛋白质的吸附性最好。 2、菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜 3、二、免疫荧光技术 ：是利用荧光素标记的抗体（或抗原）杂交 检测组织、细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。 斑点杂交：制备样品DNA，加到多管吸印仪孔中，在负三、免疫印迹杂交 四、单克隆抗体技术 压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，第五节 分析微生物学检验技术 取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进利用现代科学仪器结合微生物的特点，相互渗透，交叉结行杂交。 合，发展建立起来的一门新兴边缘学科。 印迹杂交：将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂应用：细胞组分分析、代谢产物分析、细胞生长过程的分糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液析 中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸一、生长过程的测定 纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。 二、细胞组分及代谢产物的分析 二、DNA聚合酶链反应(PCR) 三、细菌自动化鉴定系统原理：类似于DNA的体内半保留复制，主要由高温变性、http://www1.im.ac.cn/fox/index.html 低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成 1、微量培养板 2、扫描记录装置 3、鉴定系统 第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度引物、自动微生物药敏分析系统---2000型 dNTP一起至数分钟，让 ＤＮＡ模板变性变成单链。 配套的生化反应试板条,配上自动读数仪和电脑分析软件,第二步叫“退火”，让样品的温度下降到42摄氏度左右一组成一套完整自动的微生物药敏分析系统。 到数分 钟，引物就可以结合到模板上去。 VITEK系统：鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变数分钟，Ｄ ＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出而产生的不同颜色，来判断反应的结果。 新链。 MicroScan Walk/Away系统：除采用传统呈色反应外，同特点：高敏感性、高特异性、简便、快速。 时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外应用：检测标本中某些微生物，尤其是对难以培养微生物酶。
第三章 细菌分类方法 AA氧化酶阴性，以周生鞭毛运动或不运动?..肠杆菌科 第一节 细菌的传统分类
特点：主要进行细菌的形态和生理生化性状描述 第二节 数值分类 优点 ：能很好地认识和区分细菌 一、定义和原理 缺点：不能准确地反映细菌的系统发育关系。 1、定义 ：是在大量生物个体进行大量性状观察的基础上好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌检索表 对研究数据进行收集和计算机处理，计算出所有供试个体A氧化酶阳性，以极毛运动或不运动 之间的相似性，进而在这些相似性的基础上将全部供试个B通常以极毛运动，不寄生于脊椎动物和鸟类??弧菌科 体排列成群。 C绝大多数菌最适温度30oC以下(唯邻单胞菌属37oC) 2、原理：根据“等权”原则：即在建立分类单元时给分D生长需要Na+(霍乱弧菌除外) 类单位的各个性状以相等的权重。 E在胞内积累PHB，但不利用PHB????..发光杆菌属 包括三个基本原则：(1)、最大限度地包容信息，即对所EE非上述??????????????..弧菌属 有的供试个体做所有可能的实验； DD生长不需要Na+ (2)、数据的收集与分析应是客观的和公正的，结果的确E具酯酶，甘露醇不产酸????????..气单胞菌属 定应以专家的经验为基础，每项实验结果都给以同等重EE不具酯酶，甘露醇产酸???????邻单胞菌属 视，具有相同的权重(等权原则)； CC最适温度37-39oC，生长极缓慢???..水栖菌属 (3)、依据表型分析结果得出的相似性来确定表观群。 BB不运动，寄生于脊椎动物和鸟类????巴斯德氏菌3、表观群(Phenon)：即建立在表观相似性基础上的类群。 科 4、OTU运筹分类单位：菌株
工作步骤
第一步，收集数据：选择菌株，进行实验以获得性状状态。
第二步，数据编码：将实验结果格式化编码排列，以适于计算机分析。
第三步，计算机分析：将实验的编码结果输入计算机，计算菌株间的相似性或相似度，建立菌株间的相似性矩阵并完成聚类分析，即归群。 Sj(相似系数)=a/(a+c+b)
匹配系数注：n=a+b+c+d a表示两个OTU皆为“1”，b表示一个OTU为“1”，另一个为“0”；c表示一个OTU为“0”，另一个为“1”，d表示两个OTU皆为“0”。
第四步，解释结果：对该计算结果与其他资料比较做出评价，得出分类结论。
第五步，表观群描述：对分析形成的表观群进行描述，建立新的分类群或对现有分类系统进行修订。
第三节 细菌分类中的核酸分析 链螺旋不断变成单链，导致它在260nm的紫外吸收值明
一、DNA组成的测定： G+C/(G+C+A+T)*100 显增加，紫外吸收值增加的中点值所对应的温度，为解链测定的方法：纸层析法、热变性法、高效液相色谱法、浮温度(Tm值)，Tm值的大小与G+C%含量成线性关系。 力密度法。 二、DNA分子杂交 (一) DNA碱基组成在细菌分类鉴定中的作用 原理：变性的单链DNA在一定的条件下，可以靠碱基的1、它是细菌种、属描述的一项必需特征。重要的固有的配对自动恢复成双链。 特征。 方法：液相杂交和固相杂交 2、有助于界定细菌种、属，种内相差小于3%，属内相差 液相复性速率法原理：变性DNA在溶液中复性(杂交)为10-15% 时，同源DNA比异源DNA的复性速度要快，同源程度3、可作为判定细菌科属间亲源关系的参考标准。 越高，复性速率越快，杂交率也越高。 (二)测定原理 应用：1、可以明确界定细菌种。 2、可以对新菌种、热变性原理： DNA的解链温度与不同碱基组分的含量有或表型性状差别很小而难于肯定的菌株做出较可靠的判关，当DNA分子在一定的离子强度和PH条件下逐步升定。温加热变性时，随着碱基之间氢键的不断打开，互补的双
三、16SrRNA同源性分析
rRNA分子具有高度的保守性，表现在： 1、功能保守。2、碱基组成保守。
3、一级结构保守：总的看来保守，其中有些部分进化快，有些部分进化慢。 4、高级结构保守。