实验一 利用流动细胞仪测定植物DNA含量
一、实验目的
1、了解流动细胞仪的基本构造、原理与应用。 2、熟悉流动细胞仪的基本操作。 3、学会流动细胞仪样品制备及结果处理。
二、实验原理
单个细胞、细胞群或其他生物微粒经过特异的荧光染料染色（DAPI或PI或免疫荧光标记）之后，在气体压力下，通过样品管引入到喷嘴内形成样品流，样品流经过激光束（488、405等）照射，样品流中的细胞吸收光能后发射出荧光，然后经相应的检测器检测，检测结果以直方图、二维散点图或三维立体图的形式显示出来。根据荧光强度与胞内生物大分子含量的比例关系，对细胞进行定量分析。
三、实验步骤
1、从野外取新鲜幼嫩的叶片（或竹笋） 。
2、将新鲜的叶片（或竹笋）切取1平方厘米大小，放进干净玻璃培养皿中。
3、加入500μL PARTEC公司流式细胞仪自带的cystain UV precise P Nuclei Extraction Buffer滴于样品上。
4、用双面刀片将样品剁碎，核提取2-3分钟。
5、然后再加入2mL 仪器自带的cystain UV precise P stain Buffer进行细胞核染色4分钟。 6、利用移液枪吸取染色后的样品，经公司自带的滤膜过滤到5mL的测量管中，进行测量。
四、实验结果
水稻平均峰值25.25，用所测竹种的数值除以水稻平均峰值25.25就是该竹种的DNA含量所对应的DNA含量。水稻（2C=1pg） 获得类似下图结果 450 400350 300 250200 150 10050 0-500 细胞数量50 100150200相对DNA含量（道）250300白纹阴阳竹平均峰值为(104.71+108.5+109.37)/3=107.53 白纹阴阳竹DNA含量：2C=107.53÷25.25×1pg=4.26pg
实验二 石蜡切片技术
一、实验目的
在有关植物胚胎发育和组织器官的形态建成研究的过程中，都需要应用到石蜡切片技
术。在植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别，以及林木材性鉴别等方面的研究和教学工作中，由于各作物器官的性质差异以及研究目的的不同，就需要用不同的制片方法。开展本实验，要求学生熟悉石蜡切片从材料固定到材料观察分析的整个石蜡切片的全过程。
二、实验步骤
1、取材与固定
选取新鲜的植物材料，本实验用杨梅雌、雄花，迅速固定于FAA固定液中。 2、脱水
材料→25%酒精→35%酒精→50%酒精→70%酒精→85%酒精→95%酒精→100%酒精1→100%酒精2，每级2h。 3、透明
材料→100%酒精→2/3酒精+1/3二甲苯→1/2酒精+1/2二甲苯→1/3酒精+2/3二甲苯→100%二甲苯1→100%二甲苯2，每级1.5h。 4、浸蜡
倒去部分二甲苯，将材料和少量二甲苯转入35℃恒温箱中，逐渐向装有材料的烧杯中加入碎蜡，12h后更换为纯蜡，同时将恒温箱温度调到58℃，然后每4h更换一次纯蜡，共换3次后静置12h即可包埋。 5、埋蜡
所用石蜡，质地必须纯净透明，溶点通常在48～56℃范围内，以52℃的石蜡用得更多。在材料不硬、天气不热时，宜用较低熔点的蜡。材料硬、天气热的情形下，宜用高溶点的蜡。
石蜡选定后，将石蜡切成小块，置瓷皿中加热溶蜡，待石蜡近于全部熔化时，置于温箱中。封埋过程中，石蜡的温度总以高于溶点2℃为宜，过低石蜡凝固，过高伤害材料。 6、切片与粘片
将含有材料的蜡块修整为长方体，材料处于一端。
安装切片刀，刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。
修整蜡块，刀片斜度调好后，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，然后把它固定，再转下蜡块．呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。
最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，将切出的蜡带，平展于盒内以供粘片。
粘片时，以记号笔在载玻片上编号,滴加1或2滴1%明胶溶液，用胶头滴管将溶液涂匀，
滴加1或2滴展开剂，然后将切好的蜡带平整地放置在溶液上,置烤片机上的烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度，烤片温度为42℃。1~2min 后用滤纸吸去多余液体，再放置于烘片台上烘烤1~2min,待材料和蜡带干后装入切片盒中。 7、脱蜡
一般粘片后的材料需放置2~3天后方可脱蜡、染色。
将粘有材料的载玻片放入纯二甲苯中，然后逐级过渡到蒸馏水中。
载玻片→100%二甲苯1→100%二甲苯2→1/2二甲苯+1/2酒精→100%酒精1→100%酒精2→95%酒精→85%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，每级5min。 8、染色
本实验选用番红与固绿色法：
番红用l％的水溶液，固绿用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步骤如下：切片在二甲苯中脱蜡（下降至蒸馏水）→1%番红水溶液→50%酒精→70%酒精→85%酒精→0.5%固绿→95%酒精→100%酒精1→100%酒精2→1/2纯酒精+1/2二甲苯→100%二甲苯1→100%二甲苯2，脱水过程停留时间为5min，番红染色时间2~4h，固绿染色时间为20min，固绿染色后的停留时间为10s。 9、胶封
用中性树胶封片。向材料中滴加1~2滴中性树胶，从一端开始逐渐盖上盖玻片，晾干镜检并拍照。
四、实验结果
A B
杨梅雄花花药发育不同时期图（20×）
图A为花粉母细胞减数分裂过程中的二分体时期，图B为四分体时期。
实验三 植物染色体标本的制备
一、实验目的
不同植物染色体数目及大小会存在很大的差异，因此针对不同的植物有不同的染色体制备方法，本实验用酶解去壁的染色体制备方法，对毛竹、山核桃染色体进行制备，观察制片效果。
二、实验材料
秋水仙素、8-羟基喹啉、甲醇、乙酸、双蒸水。纤维素酶、果胶酶，均购置sigama公司。 新鲜的毛竹根尖和山核桃茎尖。
三、实验步骤
1、取材
作为染色体研究材料，取材部位必须准确，必须少而精，切忌多而杂，同时材料要新鲜，尽可能保持其生活状态。 2、预处理
采集新鲜的根尖立即放入预处理药品秋水仙素中。预处理时间一般3-4小时为宜。 3、材料固定
将根尖从预处理液中取出，用滤纸吸干，用固定液(甲醇：乙酸=3:1)固定，-20℃冰箱保存。 4、前低渗
将根尖直接从固定液中转入0.075摩/升KCL溶液进行低渗处理，在25℃左右低渗30分钟。可适当提前些时间对材料进行切割，材料切割大小一般控制在1毫米左右。 5、酶解去壁
吸去KCL溶液，加入2.5%的混合酶液，37℃条件下酶解2-3小时，酶解过程中将材料轻轻摇1-2次，使酶液充分起作用。 6、后低渗
吸去酶液，向材料中加入重蒸水轻轻的冲洗2-3次，根据酶解消化的程度，在重蒸水中停留10-30分钟进行后低渗处理。 7、制片
吸出重蒸水，向材料中加入固定液（甲醇：乙酸=3：1），-20℃固定30分钟。取出3-4个根尖置预冷的载玻片上，用镊子迅速夹碎，滴一滴固定液，将载玻片一端抬起，让细胞迅速散开，在酒精灯上烤干。 8、镜检
相差显微镜下镜检制片效果，选取染色体形态比较好，分散比较开的染色体制片进行后续研究。
四、实验结果
在相差显微镜下进行镜检，选取染色体形态比较好、分散比较开的染色体制片保存，以进行后续研究。
实验四 植物染色体C-分带技术
一、实验目的
染色体分带(chromosome banding)是60年代后期发展起来的一项细胞学技术，借助于某些物理、化学处理使中期染色体显现出深浅不同的带纹，各物种的每一条染色体其带纹的数目、位置、宽度及深浅都有相对的恒定性。因此，染色体分带是染色体识别的重要依据。这种技术已经成为鉴别基因组中各个染色体或较大染色体片段、追踪外源染色体的有效手段。
二、设备、药品
1、实验设备
（1）相差显微镜、荧光显微镜，配有显微照相系统。 （2）磁力搅拌器、水浴锅、温度计、计时器。
（3）其它用具：脱水缸、500ml烧杯、三角瓶、漏斗、移液管、吸尔球、镊子、滤纸、吸水纸、容量瓶等。 2、药品
（1）饱和Ba(OH)2溶液（现配现用）、NaCL 、Na3-citraate、盐酸。2×SSC溶液、0.2N HCL。 （2）Giemsa染液母液：购置sigama公司。 （3）二甲苯、镜油。
三、实验步骤
（1）将2N HCL和20×SSC溶液均稀释10倍，分别取出50ml于脱水缸中，置水浴锅中水浴至60℃。
（2）将搅拌好的饱和Ba(OH)2溶液通过漏斗过滤，去除未溶固体Ba(OH)2。 （3）将分散良好的中期染色体制片，在60℃0.2N HCL中酸变性2分钟30秒。 （4）从盐酸中取出，自来水中涮一下，移至饱和Ba(OH)2溶液中碱变性7分钟。 （5）自来水冲洗干净，转入2×SSC溶液中，60℃处理1小时。
（6）将制片转入新配制的Giemsa染液中染色。（一般2小时左右观察一次，看染色体带纹情况及染色速度）。
（7）染色结束后，将制片从染液中取出，气干，滴一滴二甲苯，盖上盖玻片，Olympus BX60显微镜100倍油镜观察拍照。分析带型特征。
四、实验结果
由于各物种的每一条染色体其带纹的数目、位置、宽度及深浅都有相对的恒定性，染色体分带是染色体识别的重要依据，所以可用来鉴别基因组中各个染色体或较大染色体片段、追踪外源染色体。