不同分子量水溶性壳聚糖的制备——氧化降解法
1课题来源
实验室研究
2研究的目的意义及主要内容
2.1目的意义
2.1.1壳聚糖简介
壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素，是由甲壳素经脱乙酰反应转化变成的分子量为12~59万的生物大分子。
壳聚糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，具有许多特殊的物理化学性质和生理功能，在纺织、印染、造纸、食品、化工、环保、农业及医药等领域都有很高的实用价值。
2.1.2壳聚糖及壳低聚糖功能
壳聚糖可抑制细菌、霉菌生长，因此常加于腌制食品中或用于海产(虾)、水果(荔枝、猕猴桃)的保鲜。但是壳聚糖分子量很大，不能直接溶于水，其实际应用功能受到了很大的限制。因此，只有在分子量及其分布降低到一定程度时，壳聚糖的许多独特功能才表现出来。
低聚壳聚糖不仅保持了壳聚糖大分子所具有的某些功能性质，如降低胆固醇、降血压、防治糖尿病、强化肝脏机能等等，而且还具有许多高分子量的壳聚糖所不具备的独特的生理功能，如保湿性、免疫调节、防癌、调节肠道茵群、功能性甜味剂、作为营养强化剂的载体等等。因此，选择适当的方法对壳聚糖进行降解，并控制其分子量及其分布就显得尤为必要。因此，低分子量壳聚糖的开发具有重要而实用的意义。
2.1.3降解主要方法
壳低聚糖目前在国内外已经用于各个行业中，寻找能够规模生产具有生物活性壳低聚糖的方法和途径是目前甲壳素化学研究的热点和难点。现在制备壳低聚糖的工业化方法主要有物理降解法和化学降解法。物理降解法包含辐射法，光降解法，微波降解法，超声波降解法等。化学降解法主要是酸降解法和氧化降解法，还有酶降解法。
这些降解方法中，酶降解法不发生副反应，反应条件温和，工艺较易控制，但是酶价格昂贵，不易实现规模化；酸水解法的优点是价格低廉，操作简单，缺点是反应难以
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控制，得到的低分子量壳聚糖的分子量分布难以控制，并且对环境污染严重；辐射降解成本低，反应易控制，无污染，产品品质高，降解后壳聚糖的生物相容性不受影响，但γ射线辐射容易引起一些交联和歧化反应，需要进行进一步的研究。
氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法， 其中的H2O2氧化降解因成本低、降解速度相对较快、产品分子量低且分布窄，无残毒、易实现工业化而倍受关注。
2.2研究的主要内容
本次研究主要内容是通过粘度的测定，分子量的测定与计算以及红外表征，探讨酰化改性，过氧化氢氧化降解制备不同分子量水溶性壳聚糖时的各种影响条件（包括pH值、过氧化氢的浓度、温度、反应时间、乙酰化度等），从而寻求一种有效的制备不同分子量水溶性壳聚糖的方法。
3国内外研究现状及发展趋向
3.1研究现状
氧化降解是现阶段研究和生产最多的一种方法，其优点是成本低、易处理、无残毒、易于实现工业化生产。
据文献报道，覃彩芹[1]等人在研究中发现，采用2% HAc溶液作为介质，H2O2用量(与糖单元摩尔比) 2. 0、75℃条件下反应7h，可以获得平均分子量为3500的低聚壳聚糖产品；同时发现壳聚糖脱乙酰度越高，越容易降解。刘大同[2]等在非均相条件下，H2O2用量2. 5%、40℃反应近24h后，将分子量为60万的壳聚糖降低到2~4万。
随着研究的深入，冯小强[3]等发现在1%壳聚糖溶液中，在催化剂存在条件下，加入适量H2O2 溶液，调节pH 值3~5 进行反应；也可以将壳聚糖溶液pH 调节到11.5， 控制70 ℃左右，分批加入一定量35%的H2O2溶液进行反应，采用H2O2氧化法可得到相对分子质量为2000左右的低聚壳聚糖。楼陈钰[4]等发现降解产物分子量分布随降解温度升高变宽，而反应时间的延长，过氧化氢用量的增加，壳低聚糖的分子量分布( PD)变窄。邢树文[5]还发现，在0.004％~1.0％的次氯酸钠及0.01％~3.5％的过氧化氢溶液中加人适量盐酸，处理壳聚糖，甚至可以可得到分子量为600的低聚壳聚糖！郭峰等研究发现，反应时间对产品的颜色和产率影响最大，一般以6 h为宜；反应温度一般以60~70℃为宜，温度太高会使部分壳聚糖炭化；双氧水的浓度一般以3%~10%为宜，浓度过高会影响产物的颜色和产率；酸性介质HAc的浓度一般在1%~5%之间即可，酸度太大对降解不利。
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由文献可知，壳聚糖的氧化降解条件研究较多，但主要是针对高脱乙酰度的原料壳聚糖进行的降解。对酰化改性后的降解研究却鲜有报道。本次研究就是考察酰化改性后的壳聚糖的降解条件，以及与高脱乙酰度的原料壳聚糖的降解对比。
关于壳聚糖酰化改性，可根据文献酸酐可以得到。
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所述方法，在壳聚糖醋酸溶液中加入甲醇和醋
3.2发展与展望
低聚壳聚糖由于其独特的生理活性而受到人们越来越多的关注。目前，国内对H2O2氧化降解法研究较多，但是降解过程伴随的副反应还需要探索出有效的遏止方法，另外必须注意氧化降解对产品活性的影响以及是否存在残留的H2O2对食品安全性产生隐患也是值得考虑。可以预见，在不久的将来，一种安全，高效的壳聚糖降解方法将消除这些问题。
4研究方法及研究手段
本课题选择用H2O2降解壳聚糖，通过对壳聚糖的酰化改性，粘度的测定以及红外表征，探讨酸度、温度、双氧水含量、反应时间、不同脱乙酰度对降解壳聚糖能力的影响，从而确定其降解壳聚糖的最佳条件。
4.1实验方法：
4.1.1壳聚糖的脱乙酰度测定
取定量分析纯样品，溶解于标准盐酸溶液中，加人2~3滴甲基橙一苯胺蓝混合指示剂，由于壳聚糖自由氨基呈碱性，可与酸定量地发生质子化反应，用碱可反滴定溶液中游离的H+，从用于溶解壳聚搪的酸量与滴定用去的碱量之差，即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的盆，从而计算出壳聚糖中自由氨基的含量。公式如下：
氨基含量：
脱乙酰度：
式中：C1 、V1 和C2 、V2分别为HCl和NaOH的浓度(mol/L) 、体积(L)；0.016 为—NH2基团的化学式量( Kg/mol)；m为原壳聚糖质量( Kg) 。
4.1.2分子量的测定
称取一定量干燥样品，溶于25 mL 的CH3COOH + CH3COONa缓冲溶液中。混合液用乌式粘度计在30±0.3℃的恒温水浴中测定粘度。作ηsp/c―c 和lnηr/c―c 图，并
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外推至c＝0，求出特性粘度值。按下式计算粘均分子量：
[?]?1.81?10?3M?0.93
其中：[η]为样品的特性粘度；ηr 为相对粘度；ηsp 为增比粘度；Mη为被测样品分子量。
4.1.3红外光谱分析
将不同分子量的壳聚糖KBr压片，在，400～4000cm -1 区间扫描。
4.2方案设计
4.2.1壳聚糖的酰化改性
将一定量壳聚糖溶解于醋酸溶液中，缓慢搅拌溶解，然后加入一定量甲醇，得到均匀透明的微黄色溶液，然后再加入一定量醋酸酐，室温下搅拌反应过夜。
4.2.2不同反应条件的影响
1. 取一定量壳聚糖溶解在CH3COOH + CH3COONa缓冲溶液中，配制成一定浓度的壳聚糖溶液。采用正交试验，考察温度、pH值、双氧水浓度的影响，正交表设计如下：
表1. 因素与水平
因素 水平 1 30℃ 2.6 1% 2 45℃ 3.8 3%
3 60℃ 4.2 5% 4 75℃ 4.6 7% 温度 pH值 双氧水浓度 表2. 正交表 编号 （1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9） （10） 温度 1 3 2 4 1 3 2 4 1 3 pH值 2 4 4 2 3 1 1 3 1 3 双氧水浓度 3 1 3 1 1 3 1 3 4 2 组成 30℃ 3.8 5% 60℃ 4.6 1% 45℃ 4.6 5% 75℃ 3.8 1% 30℃ 4.2 1% 60℃ 2.6 5% 45℃ 2.6 1% 75℃ 4.2 5% 30℃ 2.6 7% 60℃ 4.2 3% t/时间 ① ② ③ 4
（11） （12） （13） （14） （15） （16） 2 4 1 3 2 4 3 1 4 2 2 4 4 2 2 4 2 4 45℃ 4.2 7% 75℃ 2.6 3% 30℃ 4.6 3% 60℃ 3.8 7% 45℃ 3.8 3% 75℃ 4.6 7% 2.不同反应时间对壳聚糖降解反应的影响
取定量壳聚糖溶解在CH3COOH + CH3COONa缓冲溶液中，配制成不同浓度的壳聚糖溶液。在最佳条件下，恒温反应不同时间，测定不同组的粘度，计算分子量。
5.不同脱乙酰度壳聚糖降解反应
用高脱乙酰度的壳聚糖，溶解在CH3COOH + CH3COONa缓冲溶液中，配制成一定浓度的壳聚糖溶液。在以上最佳条件下反应，测定粘度，计算分子量。
在前述中制备的酰化改性后的科举糖溶液中，如上反应条件，相同处理。 4.2.3反应产品的提纯回收
在上述反应结束后，冷却、抽滤，滤液用氢氧化钠溶液调节至 pH 9，静置2h 后过滤，得非水溶性产品。滤液在50℃下减压浓缩，浓缩液用2~3 倍量的无水乙醇析出沉淀，静置过滤，无水乙醇洗涤数次至中性，冷冻干燥，得水溶性产品，进行产品表征测定。
5课题安排进度
1. 1-3周 查阅文献、收集资料，写一篇3000字左右的开题报告进行开题； 2. 4-10周 进入实验室做实验； 3. 第8周期中检查
4. 11-13周 论文撰写，翻译一篇有关的英文文献； 5. 13周 交论文； 6. 14周 论文答辩。
6实验基础
在开展这次课题研究的前期工作中，本人查阅了许多相关资料，对此课题研究的领域有了进一步的认识了解，而且在大学期间学习了四大基础化学，掌握了一定实验技能，并且指导老师在这一领域从事了多年的研究，在其指导下，既可以提高课题完成的进度，也可以达到满意的结果
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