琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
一 实验原理
将两个电极插在电解质溶液中，通上直流电，正离子则向负极移动，而负离子向正极移动，这种现象就是我们熟悉的电泳现象，也称“电泳”。概括而言，电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。
各种电泳技术具有以下特点：①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；②样品用量极少；③设备简单；④可在常温进行；⑤操作简便省时；⑥分辨率高。
本实验采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2~20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子或片段泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外（电荷效应），还与DNA分子的大小和空间构象有关（分子筛效应）。DNA的相对分子质量越大，其电泳的迁移率就越小。共价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅0.5～1μg，超薄平板型琼脂糖凝胶所需样品DNA量可以更低。凝胶浓度与被分离DNA样品的相对分子质量成反比关系，一般常用的凝胶浓度为1％～2％。在电泳的形式上常用平板型电泳，因为平板型电泳可将多个样品和标准相对分子质量DNA放在同一块胶上进行电泳，使各样品在相同的条件下进行电泳，便于相互间的比较。
电泳时，用溴酚蓝示踪DNA样品在凝胶中所处的位置，但每种DNA样品
所处的准确位置需要用新型核酸染料GoldView对DNA分子进行染色才能确定。在紫外光的激发下发出绿色荧光。
琼脂糖凝胶电泳具有下列优点：（1）琼脂糖含液体量大，可达98～99％，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂糖作为支持物有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作检测。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制备。
二 试剂与器材
1、试剂： （1）50×TAE缓冲液：称取Tris碱242g，量取57.1ml冰醋酸及200ml0.5mol/L的EDTA溶液，用蒸馏水加至1L。 （2）1×TAE缓冲液（pH8.1）：将50×TAE缓冲液用蒸馏水稀释50倍。用作电泳缓冲液和配制琼脂糖凝胶。
（3）1%的琼脂糖溶液：称取1g琼脂糖，加入100ml1×TAE缓冲液，微波炉加热熔化。
（4）核酸染料GoldView（北京赛百盛基因技术有限公司）。 （5）6×loading buffer载样缓冲液（含溴酚蓝和二甲苯氰FF）。
（6）DNA marker（北京全氏金公司）。 2、器材：电泳仪（Bio-Rad公司）、电泳槽（北京六一）。
三 实验步骤
1、配制足量的电泳缓冲液（1×TAE或0.5×TBE）用以灌满电泳槽和配制琼脂
糖凝胶。
2、根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到三角烧瓶中。（配制1%的琼脂糖溶液100ml）。
3、用牛皮纸松松地盖住三角烧瓶口，在沸水浴或微波炉（火力40，时间：新胶5分钟，旧胶3分钟）内加热至琼脂糖熔化。
4、待熔化的凝胶稍冷却后（不烫手）加入3ul GoldView核酸染料。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。
5、琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。
6、浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。
7、让凝胶溶液完全凝结（室温下30-45min）。加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液，将凝胶安放到电泳槽内。 8、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。 9、取出DNA溶液5ul并加1ul 的6×loading buffer（凝胶加样缓冲液），混匀。 10、用微量移液器及一次性吸头将样品混合液（5ulDNA提取液+1ul6×loading buffer）缓加至凝胶的加样孔内。DNA marker加至样品孔最左侧的一个孔内。
11、关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予1-5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准（电压调至130v左右）。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离（胶的中部）后再停止电泳。
12、当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖。紫外灯（凝胶成像系统）下观察结果，拍照。
附：琼脂糖凝胶电泳操作注意事项：
1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。