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本次实验项目： 肝脏谷丙转氨酶活力测定 本次实验课时：验证性 4学时 教学要求： 1．掌握实验原理，了解转氨酶的性质及临床意义 2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 重 点：实验原理、转氨酶的转氨基作用。 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．相关知识…………………………………………………………… …… 0.1 学时 2．实验目的………………………………………………………………… … 0.1 学时 3．实验原理…………………………………………………………………… 0.3 学时 4．实验操作 …………………………………………………… … 0.2 学时 实验教学 肝脏谷丙转氨酶活力测定实验的操作技术…………………………… …… 3 学时 参考资料 《生物化学实验》
肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）
相关知识
１．酶的提纯基本操作程序及基本原则
２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定） ３．测定酶活力一般经如下几个步骤 ①选择适宜的一定浓度的底物。 ②确定酶促反应的条件。优化条件
③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度） 。 ④反应到一定时间后取出反应液终止反应。 ⑤测定产物的生成量。
⑥计算酶活力、酶的比活力。
４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标
? 每单位酶蛋白所含的活力单位数。
? 对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白 ? 对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液
? 比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。 ５．总活力、纯化倍数和回收率
６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法 ７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用
８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？
谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。其次是肾、心、骨骼肌、脾等。AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。
①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。
②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的） ③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标： 急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑ 心肌梗塞：S-GOT↑↑
一、实验目的
１．了解转氨酶的性质及临床意义 ２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理
联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。丙酮酸能与2,4－二硝基苯肼结合，生成丙酸－2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于测定丙酮酸的含量。α－酮戊二酸也能与2,4－二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸－2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm波长比色时，丙酮酸－2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α－酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。
谷丙转氨酶（简称GPT、ALT,在血清中的正常值是5(0)~40U/L以内）
催化反应：丙氨酸 + α-酮戊二酸 丙酮酸＋ 谷氨酸
CH3
丙氨酸
GTP
CH3
丙酮酸
三、实验器材、试剂、材料 (一)材料 新鲜猪肝脏
（二）器材 722型分光光度计、剪刀、吸管、玻璃均浆器 （三）试剂
１．标准丙酮酸溶液（１ml相当于500ug）；准确称取纯化丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.5mol/LH2SO4中，临用前配制。
２．谷丙转氨酶底物；称取L-丙氨酸0.90g及α-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液中，然后用１mol/LNaOH调至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml，贮藏于冰箱内，可保存一周。
３．0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）；称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中。
４．0.02%2,4－二硝基苯肼；称取2,4－二硝基苯肼20mg溶于少量１mol/L HCl中，加热溶解后，用１mol/L HCl稀释到100ml。
５．0.4mol/L NaOH溶液 ６．生理盐水 四、实验操作步聚
准备工作：打开水浴锅恒温37度；722E型分光光度计通电预热。
1.肝匀浆制备（每四组做1份，共用）
①将鸡肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆
管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。
②吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）。 2. 谷丙转氨酶活力测定（每组做1份）
取试管4支按下表加液 谷丙转氨酶底物/ml 测定管 0.5 标准管 0.5 对照管 - 空白管 - 混匀后，37℃水浴准确保温5分钟 稀释肝匀浆/ml 标准丙酮酸 水 0.1 - - - 0.1 - 0.1 - - - - 0.1 混匀后，37℃水浴准确保温30分钟 2,4－二硝基苯肼/ml 谷丙转氨酶底物/ml 0.5 - 0.5 - 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀后，37℃水浴准确保温30分钟 0.4mol/L NaOH A520 5.0 5.0 静止10分钟 5.0 5.0 谷丙转氨酶活力单位：规定酶在37℃与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸为一个谷丙转氨酶活力单位。
五、实验结果与讨论
1. 谷丙转氨酶活力计算基础：规定酶在37℃与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位。
2. 测定管－对照管的吸光度值，与标准管相比算出其相当于丙酮酸含量。 3. 根据公式计算：（注意稀释倍数，理解公式） ①每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位： ②每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。 4．计算出比活力
比活力＝活力单位/ml酶液 六、注意事项
１．分析（列表）各管与计算实验结果（OD值）相关的物质成分。 管别 空白管 标准管 各管与实验结果有关的呈色反应的物质来源 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 2,4－二硝基苯肼 ＋ ？ 对照管 测定管