第一章 绪论
1. 生物技术的概念，基因工程、细胞工程、发酵与酶工程、蛋白质及抗体工程及生物转化的概念。P1
生物技术biotechnology又称生物工程bioengineering，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。 基因工程genetic engineering也称遗传工程，是现在生物技术的核心和主导。主要原理是应用人工方法将生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。（DNA重组技术，分子杂交技术，基因操作） 细胞工程cell engineering 指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。
发酵工程fermentation engineering 是通过现代技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术体系。
酶工程enzyme engineering 是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。 抗体工程antibody engineering是利用细胞生物学或分子生物学手段在体外进行遗传学操作，改变抗体的遗传特性和生物学特性，以获得具有适合人们需要的、有特定生物学特性和功能的新抗体，或建立能稳定获得高质量和产量抗体的技术。
生物转化biotransformation也称生物催化biocatalysis是利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系的酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。
2. 生物技术药物biotechnological drug 是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。 生物技术药物的特性：
（1）理化性质特性：相对分子质量大，结构复杂，稳定性差。
（2）药理学作用特性：活性与作用机制明确，作用针对性强，毒性低，体内半衰期短，有种属特异性，可产生免疫原性。
（3）生产制备特性：药物分子在原料中含量低，原料液中常存在降解目标产物的杂质，制备工艺条件温和，分离纯化困难，产品易受有害物质污染。
（4）质量控制特性：a质量控制内容的特殊性（质量标准：基本要求、制造、检定等；化学药物的质量标准：性状、鉴别、检查、含量测定等），b制造项下的特殊规定，c检定项下的特殊规定。
3. 生物技术制药biotechnological pharmaceutics是指利用基因工程、酶工程、发酵工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。
第二章 基因工程制药
4. 外源基因在原核生物中表达的重要调控元件 P17
A启动子promotor是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，其功能是起始目标基因mRNA的合成，是决定外源基因在原核生物中表达效率的关键因素。
B核糖体结合位点：SD序列。C终止子：终止子序列terminator sequence是基因3’-末端能被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定DNA序列。
5. 外源基因在大肠杆菌中的表达方式：P18 a胞内表达：非融合蛋白的胞内表达和融合蛋白的胞内表达，b分泌表达：分泌至周质和分泌至胞外。 6. 大肠杆菌中外源基因表达效率的影响因素 P18-P19
A外源基因密码子，B、mRNA结构，C表达载体，D、外源蛋白稳定性 7. 酵母表达系统的优点：高表达量，高稳定性，翻译后修饰功能，分泌表达。 8. 外源蛋白在酵母表达系统中的影响因素 P20
a外源基因结构，b表达形式及信号肽的选择，c启动子，d转化子的拷贝数， e甲醇诱导浓度、时间、温度，f外源蛋白的降解。
9. 基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面 P30 A鉴别方法不同：基因工程药物的Mr远大于小分子化学药物。 B鉴定方法不同：基因工程药物结构复杂（空间结构），需要多种检测方法。 C杂质来源不同：基因工程药物杂质来源于宿主蛋白残留和宿主基因残留。小分子药物杂志来源于合成过程中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留。 D药物定量方面，基因工程药物定量方法一般采用生化反应的方式。
10. 基因工程药物质量控制的项目：a蛋白含量测定、b蛋白纯度分析、c蛋白性质测定、d生物学效价测定、e杂质分析等。 (1)蛋白质含量测定方法：
a.紫外吸收法：280nm处吸收峰，优点：快速、对蛋白质无破坏性。缺点：不是严格定量，核酸可引起强干扰。
b .BCA法：二辛可宁酸bicinchoninic acid,在562nm处有最大吸收。
c .Lowry法：福林-酚试剂，灵敏，准确度高，操作步骤多，影响因素多。 d.考马斯亮兰法：595nm处有最大吸收。灵敏，操作简单，抗干扰能力弱。 e. SDS-PAGE扫描分析法。
(2)蛋白质纯度检测的方法：a电泳法，b质谱法，c层析法，d末端氨基酸残基分析法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶法（电泳法）是目前最常用的鉴定蛋白质纯度的方法。
第三章 动物细胞工程制药
动物细胞工程animal cell engineering 是指根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门学科。 11．体外培养动物细胞的类型P47：贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞。
12．动物细胞培养的条件P48：培养温度25-28度。PH值7.2-7.4，低于6.8或高于7.6对细胞生长不利。通氧量：CO2培养箱。防止污染：显著污染的标志PH值迅速改变、细胞外形模糊、出现漂浮的细胞集落，加入抗生素。基本营养物质。渗透压。
动物细胞培养特性：（1）细胞比微生物细胞和植物细胞大，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差，（2）倍增时间长，生长缓慢，（3）对培养基要求高，易受污染，加入抗生素。（4）贴壁生长，有接触抑制现象。（5）产物分泌于细胞外。
13．培养方式：细胞的原代培养、传代培养、细胞克隆培养P50 原代培养：组织块培养法和单层细胞培养法
组织块培养法tissue culture 是将动物组织切成直径1~2mm3小块进行培养的方
法。
单层细胞培养法monolayer cell culture是将动物组织块中粘连在一起的细胞用酶法或物理分散法分散成单个细胞，制成细胞悬液，经计数、稀释后，接种于无菌培养液中，37C、5%CO2空气下进行原代培养，细胞即开始生长并逐渐形成单层。
细胞克隆培养法clonal culture即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。饲养细胞：小鼠胸腺细胞、腹腔细胞。
14．动物细胞培养常用的其他溶液P55：平衡盐溶液、培养基PH调整液、细胞消化液（胰蛋白酶溶液、EDTA液）、抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素）。
15．动物细胞的大规模培养方法P59：A悬浮培养法Maitland’s culture，B微载体培养法，C多孔载体培养法，D微囊化培养法，E中空纤维培养法hollow filer cell culture是模拟细胞在体内生长的三围状态，把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养可以使细胞高密度的生长。
16．动物细胞生物反应器的类型P61：a搅拌式生物反应器、b气升式生物反应器、c中控纤维式生物反应器、d透析袋式或膜式生物反应器、e固定床或流化床式生物反应器、f一次性摇袋式细胞培养生物反应器。
17．动物细胞生物反应器的主要操作模式P65：a分批式操作、b补料-分批操作、c半连续式操作、d灌流式操作、e连续式操作。
18．转基因动物制作方法P67：a基因显微注射法、b反转录病毒感染法、c胚胎干细胞法、d精子载体导入法、e基因打靶法、f酵母人工染色体法。
转基因动物transgenic animal：采用基因工程技术把外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，再经过发育途径把外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即使转基因动物。
19．细胞核移植技术nuclear transplantation 是指一个动物的细胞核移植至去核的卵细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成分一样的动物的技术。P73
第四章 抗体工程制药
20．抗体工程制药antibody engineering pharmaceutics 是指利用基因工程、细胞工程和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。P78 单克隆抗体monoclonal antibody, mAb 简称单抗，是由一个B细胞和一个骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞合成及分泌的抗单一抗原表位的特异性抗体。 21．单克隆抗体 及其制备原理（主要是理解） P79
22．抗体的结构P81：4条多肽链（2条相同的重链和2条相同的轻链）通过二硫键连接而成，为“Y”字形结构。
23．杂交瘤细胞的筛选P90：HAT选择性培养基。 24．噬菌体抗菌库技术的筛选方法P105：（1）固相或液相纯化抗原的筛选：a将纯化抗原包被在固相介质上（酶标板、免疫试管、亲和层析柱），然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。b将抗原与生物素集团相连，再将其结合在包被有链亲和素的磁珠上对噬菌体进行筛选。（2）全细胞筛选，（3）用切片组织进行筛选
第五章 疫苗及其制备技术
本章内容主要以老师的课件为主
疫苗vaccine是由病原微生物本身制备而成的抗病制剂，广义的疫苗包括细菌、病毒和立克次体等病原微生物制成的疫苗，注射或黏膜途径接种后使机体产生抗体或致敏淋巴细胞，达到特异性免疫的效果，使机体获得保护或消灭该致病原。 25．毒株须具备的条件： （1）持有特定的抗原性；
（2）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性； （3）易在特定组织中大量繁殖；
（4）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；
（5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象； （6）未被其它病毒污染。 强毒种的选育：
（1、强毒种来源：典型传染病分离培养;保藏中心提供。 （2、强毒种分离：A、纯粹试验（分离培养、鉴定）。 B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。 C、抗原性（免疫及反应抗原试验）。 D、稳定性（传代不变异）。
达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准。
（3.复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的 弱毒种的选育：（1、来源：自然界筛选和人工诱变。 （2、弱毒筛选途径：初选的依据：生物性状改变。 26．活疫苗（live vaccine）：选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。
死疫苗（killed vaccine）：包括灭活疫苗（由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性）和 亚单位疫苗（将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗） 活疫苗与死疫苗的特点 活疫苗特点： 死疫苗特点： 可在体内繁殖 不能在体内繁殖，性质稳定，安全性高 系统免疫反应和局部免疫反应 有利于制备多价或多联疫苗 免疫力持久，产量高，成本低 比较安全，不发生全身性副反应，无毒力有毒力增强和反祖危险 反祖现象 抗原干扰现象 受外界影响小，有利于保存运输 保存条件苛刻 免疫剂量大，需多次免疫，成本高 多数只需免疫一次，接种剂量小。 只能诱导机体产生体液免疫 通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果 27．疫苗的质量检测：（1．外观检查：（2．pH值检测： （3．纯度：（4．宿主细胞 DNA和蛋白残留量检测：（5.无菌检查：（6．热原或细菌内毒素检查：（7．抗生素检测：（8．灭活效果的验证：（9．异常毒性检查：（10．稳定性试验：（11．效力试验（生物效价）：（12．佐剂的质量评价：（13．疫苗标准品或参考品的研究：
28．多糖的纯化方法：A乙醇沉淀法（最常用），B分级沉淀法（用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖），C季铵盐络合法，D离子交换层析法，E凝胶过滤法 29．粘多糖的生物学特性：粘多糖是指含有氨基糖和糖醛酸或它的衍生物的多糖。 第六章 酶工程制药
30．酶的催化的显著特点P150：A催化效率高，B具有专一性，
C催化作用在体内受到调节控制(区别于一般催化剂的重要特征)，D不稳定性。 31．酶分离纯化的一般程序 及 酶原料选择的依据 P153 一般程序：（1,、原材料的选择和预处理：选择含目的酶丰富的原料，
（2、酶的分离，（3、酶的精制，（4、酶的浓缩干燥及结晶。
32．传统的酶固定化方法P155：
（1、载体结合法：物理吸附法、离子结合法、共价结合法，
（2、交联法cross-linking method：是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法，常用交联剂戊二醛、己二胺等。（3、包埋法entrapment method :是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶固定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。有网格型和微囊型。常用载体有明胶、聚酰胺、琼脂等。
固定化酶immobilized enzyme或固定化细胞immobilized cell是将具有一定生理功能的酶或生物细胞，用物理或化学方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一种技术。
33．固定化酶的性质和指标以及其优缺点P159： （1、固定化后活力的改变（增强），
（2、固定化对酶稳定性的影响：热稳定性提高，对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高，对PH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高， （3、固定化酶的最适温度变化：提高，
（4、固定化酶的最适PH值变化：用带负电荷载体，最适PH向碱性偏移；用带正电荷载体最适PH向酸性偏移。
（5、固定化酶的米氏常数Km变化：中性载体，Km上升；底物与载体电荷相同，Km增加；底物与载体电荷相反，Km减小；高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而Km变化，Km还受离子强度的影响，I升高，Km变化逐渐缩小甚至消失。
（6、固定化酶的指标：A固定化酶的活力，B偶联率及相对活力的测定，
C固定化酶的半衰期，D固定化酶的热稳定性
34．酶反应器的基本类型P162：a搅拌罐式反应器，b鼓泡式反应器， c膜反应器，d喷射式反应器，e填充床式反应器，f流化床式反应器 35．酶传感器的主要类型P162：A酶电极，B热敏电阻酶传感器，
C离子敏场效应晶体管酶传感器，D光纤酶传感器
36．酶反应器的性能评价P166：
A固定化酶的形状，B底物的物理性质，C固定化酶稳定性，D酶反应动力学特性。参数：空时、空数、转化率、生产强度。
37．酶反应器应用的注意事项P169：保持酶反应器的操作稳定性，保持酶反应器中流体的流动方式和状态，防止酶的变性，防止微生物的污染。 38．酶分子的定向进化P173：
定向进化directed evolution和杂合进化hybrid evolution是非理性化设计。