课题3 酵母细胞的固定化
1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。
2．尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。
一、固定化酶的应用实例
1．高果糖浆的生产需要使用______________，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的________好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。
2．葡萄糖异构酶固定：将酶固定在一种颗粒状的______上，再将这些酶颗粒装到一个
________内，柱子底端装上分布着许多小孔的______。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。
3．高果糖浆的生产操作：生产过程中，将____________从反应柱的上端注入，使其流过反应柱，与______________接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。
二、固定化技术的方法
1．固定化酶和固定化细胞技术是利用______或______方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用__________和__________法固定化，而细胞多采用______法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被______或______，而个小的酶容易从__________中漏出。
2．包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的____________中。常用的载体有______、________、海藻酸钠、____________和____________等。
三、实验操作
1．酵母细胞的活化
在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于______状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
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2．配制物质的量浓度为0.05 mol·L1的CaCl2溶液 3．配制海藻酸钠溶液
配制海藻酸钠溶液时要用酒精灯加热，边加热边______，加热时要用______，或者__________，直至完全溶化。
4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
5．固定化酵母细胞
以______的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的________溶液中，形成凝胶珠状，将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡____ min左右。
6．将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2～3次，放入用于发酵的葡萄糖溶液中，再置于25 ℃下发酵24 h后，会发现有气泡产生，同时有酒味散发。
工业生产中，细胞的固定化是在__________的条件下进行的。
答案：一、1.葡萄糖异构酶 稳定性 2．载体 反应柱 筛板
3．葡萄糖溶液 葡萄糖异构酶
二、1.物理 化学 化学结合 物理吸附 包埋 吸附 结合 包埋材料 2．多孔性载体 明胶 琼脂糖 醋酸纤维素 聚丙烯酰胺 三、1.休眠
3．搅拌 小火 间断加热
5．恒定 CaCl2 30 6．严格无菌 1．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的比较 直接使用酶 固定化酶 酶的种类 一种或几种 一种 常用载体 制作方法 是否需要 营养物质 催化反应 反应底物 — — 否 单一或多种 各种物质（大分子、小分子） 高岭土、皂土、硅胶、凝胶 化学结合法、物理吸附法 否 单一 各种物质（大分子、小分子） 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的 固定化细胞 一系列酶 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺 包埋法 是 一系列 小分子物质 优点 催化效率高，低耗能、低污染等 成本低，操作更容易 对强酸、强碱、高温和有机溶固定后的细胞与反剂等环境条件非常敏感，容易应物不容易接近，失活；溶液中的酶很难回收，不足 尤其是大分子物不能被再次利用，提高了生产质，可能导致反应成本；反应后酶会混在产物效率下降等 中，可能影响产品质量 2．具体操作过程中的注意事项 （1）酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要1 h左右。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。
（2）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，关系到实验的成败，一定按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠溶液浓度低，包埋细胞少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭球形，则说明海藻酸钠溶液浓度偏高，制作失败。
（3）刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
题型一 酶或细胞固定化的方法
【例题1】 试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似？（ ）
解析：A、B 选项适合于酶的固定化，C选项既用于酶固定，也可用于细胞固定。制备固定化酵母细胞用的是包埋法，即将酵母菌包埋在海藻酸钠制成的凝胶珠中，所以与D选项相似。
答案：D
反思领悟：固定化酶和固定化细胞通常采用包埋法、化学结合法和物理吸附法。海藻酸钠作载体制备的是固定化酵母细胞。
题型二 固定化酶或细胞的制备过程
【例题2】 在制备固定化酵母细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是（ ）。 A．用于调节溶液pH B．用于进行离子交换 C．用于胶体聚沉 D．用于为酵母菌提供2＋Ca
解析：海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质溶液的作用下，发生聚沉， 形成凝胶珠，其作用机理是由于盐离子的电荷与胶体微粒电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒，类似于人体红细胞与抗凝集素之间的凝集反应。
答案：C
题型三 酶和细胞固定化技术的应用 【例题3】 （2010·江苏高考改编）下图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图，下列叙述不正确的是（ ）。
A．刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液 B．图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠 C．图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触 D．图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中
解析：刚溶化的海藻酸钠应冷却后再与酵母菌混合，否则温度过高会导致酵母菌死亡。 答案：A
1．固定化酶技术常采用（ ）。 A．包埋法 法
C．活化法 D．微囊化法 2．在使用包埋法固定细胞中，下列哪一项不是常用的载体？（ ） A．明胶 B．琼脂糖 C．海藻酸钠 维素
B．化学结合和物理吸附
D．纤
3．下面是制备固定化酵母细胞的步骤，其中排列顺序正确的是（ ）。
①配制CaCl2溶液 ②配制海藻酸钠溶液 ③海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 ④酵母细胞的活化 ⑤固定化酵母细胞
A．①②③④⑤ B．④①③②⑤ C．④⑤②①③ D．④①②③⑤ 4．下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是（ ）。 A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显 B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧
C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件 D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物 5．（2011·江苏高考）下列有关酶的制备和应用的叙述，正确的是（ ）。 A．酶解法和吸水涨破法常用于制备微生物的胞内酶 B．透析、电泳和酸解等方法常用于酶的分离与纯化 C．棉织物不能使用添加纤维素酶的洗衣粉进行洗涤 D．多酶片中的胃蛋白酶位于片剂的核心层
答案：1．B 酶的体积较小，容易从包埋材料中漏出来，所以一般采用化学结合和物理吸附法固定化。
2．D 常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
3．D 制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。
4．A A项中，固定化细胞技术最大的用途就是连续催化反应。B项中，不需控制溶解氧；C项中，不需各种营养条件；D项中，糖类的作用不只是作为反应底物。
5．A 酸解法不能用于酶的分离与纯化，棉织物可以使用添加纤维素酶的洗衣粉洗涤，纤维素酶虽不能直接去除衣物上的污垢，但能使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗涤剂充分接触，使洗涤剂的去污效果更好。多酶片中的胃蛋白酶应位于片剂的最表层。