液相色谱法的建立 第一章 结论 1，引言 2，开始前应知道 3，样品的预处理与检测 4，建立分离 5，完善HPLC方法 1，引言
HPLC方法建立的步骤：
（1）有关样品的情况，明确分离目的
（2）是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等？ （3）选择检测器和检测器设置
（4）选择液相色谱法；进行预实验；估计最佳分离条件 （5）优化分离条件
（6）检查出现的问题或所需的特殊步骤 （7）定性方法；定量校正 （8）论证方法使之进入常规实验室 2，开始前应知道 2.1 样品的性质
包括：所含化合物的数目；化合物的化学结构（官能团）；化合物的分子量；化合物的pKa值；化合物的UV光谱图；化合物在样品中的浓度范围；样品的溶解度等。
两种模式：
（1）理论型：依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件； （2）经验型：直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意。 2.2 分离的目的
（1）主要目的是定量分析？一种物质的检出？未知样品组分的确认？ （2）是否有必要解析出样品的所有成分？
（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品的主要成分的精密度通常能达到±1~2%
（4）该方法应设计多少种不同的样品基质？
（5）一次将分析多少样品？当一次分析的样品数超过10个时，运行时间一般应控制在20min以内
（6）即将使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？实验人员操作技能如何？色谱柱能否恒温？HPLC系统能否做梯度洗脱？ 3，样品的预处理与检测 （1）可直接进样的溶液
（2）需稀释、pH缓冲、加入内标或其它定容操作的样品。（当样品溶剂成分接近流动相时，一般不会产生基线波动等问题） （3）必须首先溶解或提取处理的固体
（4）样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害 检测器：首选可变波长紫外（UV）检测器。 4，建立分离方法
4.1 选择HPLC分离模式与起始条件
样品：一般样品：小分子（分子量小于2000）可分为中性样品和离子样品（酸、碱、两性化合物和有机盐类）
特殊样品：大分子、无机离子、对映体、生物样品、蛋白质、肽类等 首次HPLC分离的较好实验条件 分离条件 较好的首要选择 色谱柱
尺寸（长度，内径） 15×0.46cm 粒度 5μm 固定相 C8或C18 流动相
溶剂A和B 缓冲液—乙腈 %B 80~100%
缓冲液（化合物、pH、浓度） 25mM磷酸钾，2.0＜pH＜3.0 添加剂（如胺改性剂、离子对试剂） 开始时不用 流速 1.0~2.0mL/min 温度 35~45℃ 样品大小
体积 ＜25μL 重量 ＜100μg 主要HPLC方法的特性
方法/特点/色谱柱 何时应该使用该方法？ 反相HPLC
流动相：水-有机溶剂 色谱柱：C18（ODS）、C8、苯
基、三甲基硅烷（TMS）、氰基 能溶于水-有机混合物的大多数样品，尤其是中性或非离子化合物的首选 离子对HPLC
流动相：水-有机溶剂，控制pH 的缓冲液和离子对试剂
色谱柱：C18、C8、氰基 离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择 正相HPLC
流动相：有机溶剂混合物 色谱柱：氰基、二醇基、氨基、
硅胶 当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择；不溶于水-有机混合物的亲脂样品的首选 4.2 开始方法建立
用上表的起始条件，在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。通常不推荐用中等强度的流动相开始方法建立。更好的选择是先用非常强的流动相（如80-100%B），然后按需要降低%B。
另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱。其优点：（1）确定最好的方法是用等度还是梯度洗脱；（2）估计出下一次实验（等度）的最佳溶剂强度。
4.3 改善分离 HPLC方法建立的目标
目标 评论
分离度 精密和普适性好的定量分析要求Rs＞1.5 分离时间 ＜5~10min时日常工作较理想
定量 含量测定：≤2%；要求不高的分析：≤5%；痕量分析：≤15%
压力 （如果为新柱）＜150bar最好，＜200bar通常是基本的要求
峰高 大信噪比的窄峰最好 溶剂消耗 每次运行少用流动相最好 4.4 可重现的分离
在方法建立过程中改变实验条件(流动相、色谱柱、温度)时，必须经过足够长的时间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常以10~20倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。 检验：当前后两次重复实验的保留时间恒定后可认为已经达到柱平衡。如果未平衡好而进行实验则有可能得到错误的结果。 5，完善HPLC方法 5.1 定量与方法论证
进行全面论证通常需通过简略检查方法的专属性、线性、准确性、回收率、灵敏度等而实施。 5.2 解决出现的问题
方法建立和论证期间可能出现的问题 问题 评论
塔板数低 色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响 色谱柱易变性 色谱柱选择不对，二次保留的影响 色谱柱寿命短 色谱柱选择不对，样品需预处理
保留时间变化 色谱柱平衡不够，样品需预处理，键合相流失 定量精度差 需更好地校正，找出误差的来源 出现新的干扰峰 初始分离不够或初始样品无代表性 5.3 方法的普适性
普适性好的方法是指能容忍实验条件的微小变化、一般色谱工作者容易掌握、应用时也不必使用同一HPLC系统的方法，可移交他人使用。 第二章 分离的基础 1，分离度：总论
2，分离度与分离条件的关系 3，选择性对分离度的影响
4，色谱柱理论塔板数对分离度的影响 5，进样量的影响 1，分离度：总论
分离度Rs等于两峰中心之间的距离除以平均峰宽。 1.1 分离度的测量
测量分离度有三种方法：（1）按上式计算；（2）与标准分离曲线相比较；（3）按两谱峰之间的峰谷计算。 1.2 最小分离度
基线分离相当于大小类似的两谱峰的Rs＞1.5。当在以下两种情况时，（1）相邻谱峰大小相差较大；（2）长时间使用，HPLC方法通常会性能下降。则Rs=2.0或更大应为方法建立的理想目标。不过，过度分离则意味着运行时间比所希望的要长。 2，分离度与分离条件的关系
（柱效）（选择性）（保留值）
当改变条件使k变小（流出快）时，分离度通常下降；k变大时，分离度通常可以得到改善。如果增大α，两谱峰分开也加大，因而Rs值提高显着。增加柱效N，谱峰变窄，分离更好，但在色谱图中的相对位置不变。
决定参数k和α的因素包括能影响样品保留值或样品在流动相与柱填料之间平衡分配的各种条件：（1）流动相的组成；（2）色谱柱的特征；（3）温度。
在方法建立中，最好先改变那些能优化k和α值的条件，然后改变色谱柱条件。
调整溶剂强度的目的是将所有谱峰定位于约0.5~20的k范围内（当k＞0.5时，早期流出的杂质峰与被测物峰重叠的可能性也会减小；k＜20时，可避免最末峰过度展宽，以及运行时间太长）。对于反相
色谱来说，增大%B，则k变小；降低%B，k变大。 3，选择性对分离度的影响
改变流动相、更换色谱柱填料的类型、或改变温度均能改变α。 3.1 改变流动相
反相HPLC中，能用于改变选择性（α）的流动相（从实验1改为实验2）变化
条件 实验1 实验2
改变%B（所有） 40?N 45?N 改
变
有
机
溶
剂
（
所
有） 40?N 50%MeOH
混合有机溶剂（所有） 40?N 20?N + 25%MeOH 改
变
pH
值
（
离
子） pH2.5 pH3.5
改变离子对试剂浓度（离子） 无试剂 25mM辛烷磺酸盐
改变缓冲液或缓冲液浓度（离子）25mM枸橼酸缓冲液 50mM醋酸缓冲液
改变添加剂浓度（离子） 无添加剂 10mM三乙胺
加络合试剂（特殊） 无试剂 10mM
硝酸银 3.2 更换色谱柱
更换色谱柱必然使选择性发生突变。所以只有在试图改变流动相无效后才考虑更换色谱柱。 3.3 改变温度
柱温增加1℃，保留值（k）通常能减小1~2%。 4，色谱柱理论塔板数对分离度的影响
提高色谱柱理论塔板数的因素包括：（1）色谱柱填充良好；（2）色谱柱较长；（3）流速较低；（4）柱填料的微粒较小；（5）流动相的粘度低，温度高；（6）样品分子小；（7）柱外效应小。 5，进样量的影响
对于一般的进样量范围，如用0.4~0.5cm ID的色谱柱，＜25μL与＜10μg。随着进样量的增加，最终会使谱峰展宽，塔板数N下降，样品分离度变差。这称为柱超载，分为体积超载和样品质量超载。 第三章 检测灵敏度与选择性 1，引言 2，UV检测
3，其它HPLC检测器 1，引言
大多数情况下，HPLC方法建立使用紫外（UV）检测器（包括可变波
长紫外检测器、二极管阵列检测器）。对下列情况，可以考虑选用其它种类的检测器：样品的UV吸收值很小或无吸收；被测物的浓度太低，无法进行紫外检测；样品干扰严重；需要结构定性的信息等。 检测器种类与操作在灵敏度、选择性与基线噪音三个方面影响样品组分与潜在干扰的相对响应值。 2，UV检测 2.1 总论
典型光源为氘灯，它发出的光在190~400nm的波长范围内有适宜的光强度。
吸收值A与流动池中被测物的浓度C、被测物摩尔吸收系数ε和流动池长度L的关系符合Beer定律。 A=εLC 2.2 波长的选择
（1）样品吸收值与其分子结构的关系
样品中各被测物在所选UV检测波长处必须有合格的吸收值，流动相也必须有合格的透光率。对于某些样品来说，选择样品干扰物吸收值最小处的波长可能有意义。
检测器信号A与被测化合物的摩尔吸收系数ε成正比。UV检测对于大多数样品组分的分析都有足够的灵敏度。用UV检测进行化合物的痕量分析，一般ε值不可低于100。饱和烃类以及其氨基或氰基衍生物是仅有的一类完全不适合UV检测的有机化合物。被醚基（-O-）、羟基（-OH）、氯（-Cl）、羧基（-COOH）或酯基（-COOR）取代的饱
和烃类具有临界吸收值（ε＜100），可能需在短波长处（185~210nm）检测。当检测波长小于210nm时，样品干扰物一般有强吸收，选择流动相溶剂与添加剂有些限制。
除上述这几类化合物外，一般化合物都具有较大的ε值，能在较长波长（＞210nm）检测。
（2）流动相吸收值与其组分的关系
流动相（不含样品时）在测定波长处的透光率必须足够大。当到达检测器光电管的光强度下降时，基线噪音增加，检测灵敏度降低。当流动相的A＞0.7时，基线噪音显着增加，这意味着在所用检测波长处，流动相的吸收值通常应小于0.5。当流动相的吸收值A超过1.0时，检测器状态可能已不适用。
水—180nm；乙腈—195nm；甲醇—205nm；四氢呋喃—240nm；1%醋酸—240nm；0.1%磷酸—190nm；1%三乙胺—240nm；二氯甲烷—240nm。 2.3 信号、噪音与测定精度
采用HPLC进行定量分析时，精密的结果最为重要。检测通过信噪比影响检测精度。通常基线噪音有二种：由散射光和检测器电子系统引起的短期噪音（高频），和由温度波动、泵“噪音”、和/或被污染色谱柱引起的长期噪音。 最小检知量G等于：
M—被测物的分子量；Vm—色谱柱死体积（mL）；N’—基线噪音；CV—变异系数；N—理论塔板数；L—流动池的光程长度（cm）；ε—被测
物的摩尔吸收系数。
2.4 提高信噪比，以获得更好的检测精度
当检测精度随被测物浓度变化时，增大S/N’能得到更好的精密度。增大信号S或降低噪音N’都可以使信噪比增加。选择最大吸收值处的波长能得到最大信号。
增强UV检测灵敏度（S/N’）的系统方法 （1）选择ε值最大处的波长（S） （2）进样体积尽可能大（S） （3）浓缩样品，加大进样质量（S）
（4）尽可能减小k值（但不能有基线波动或干扰峰）（S） （5）当UV检测不适宜时，考虑选用其它检测器（S） （6）增大检测器时间常数（N’） （7）确保用新灯替换旧灯（S，N’）
（8）如必要，用脉动阻尼器消除泵噪音（N’） （9）如用在线混合，匹配A、B溶剂的UV吸收值（N’） 2.5 检测器的线性范围
UV检测器的动力学范围约为2×104。动力学范围宽为UV检测器广泛应用的诸多原因之一。 2.6 二极管阵列UV检测器
二极管阵列检测器（DAD）可以在一次运行中同时采集不同波长的色谱图。运行结束后，能显示任一所需波长的色谱图。因此，DAD能够比单一波长操作提供更多的样品组成信息。而且每个峰的UV光谱图
可作为最终HPLC方法选择最佳波长的重要工具。最后，通过比较一个峰中不同位置的UV光谱，可以估计峰的纯度。如果峰中仅有一种组分，色谱峰中不同位置的UV光谱应能叠加在一起。
3，其它HPLC检测器
（1）通用检测器：示差折光检测器（RID），蒸发光散射检测器（ELSD）。此两种检测器的灵敏度比UV要低两个数量级。 （2）荧光检测器：其灵敏度比UV要高三个数量级。 （3）电化学检测器（包括电导检测器）
（4）质谱检测器：常用的接口有：电喷雾；离子喷雾；热喷雾和大气压电离接口。
（5）不常用的检测器：红外检测器，粘度仪，小角激光散射仪。 第四章 色谱柱 1，引言
2，色谱柱与柱填料的特性 3，色谱柱的性能指标 4，色谱柱问题与解决方案 1，引言
色谱柱是HPLC分离过程的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱柱，甚至来源相同、认为完全一样的色谱柱之间，可能也会存在很大差异，尤
其是不同的色谱柱在塔板数、谱峰的对称性、保留值、峰间距以及使用寿命方面会有所不同，而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大影响。
选择HPLC柱时，柱间的重现性是方法建立中极为重要的因素。 2，色谱柱与柱填料的特性 2.1 柱填料
大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒（作担体）。 HPLC分析柱的理想的微粒特性
特性 用途 5μm全多孔微粒 大多数分离 3μm全多孔微粒 快速分离
1.5μm薄壳微粒 极快速分离（尤其是大分子）
±50%（均值的）粒度分布 稳定、重现、高柱效、柱压低
7~12nm孔径，150~400m2/g（小孔） 小分子分离 15~100nm孔径，10~150m2/g（大孔） 大分子分离 （1）硅胶填充微粒
硅胶微粒的突出优点是它们的机械强度高，可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作，柱效保持稳定。刚性、高强度的微粒还使柱的反压较低，寿命较长。在用于制作HPLC填料的材料中，硅胶基质色谱柱的柱效最高。
硅胶担体的表面性质极为理想，在于其表面能通过化学改性引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。硅胶基质填料与水及所有机溶剂兼容，在更换溶剂时，填料的大小不会变化（如溶胀）。这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间，仍能保持稳定。 （2）多孔聚合物
多孔聚合物的主要优点是在pH=1~13均可用。这些色谱柱能在高pH下分离碱性溶质，这时化合物以自由态或非电离态存在，色谱峰形较好。另一潜在优点是有很强的疏水保留性，对亲水性较强的化合物也有足够的保留。
与相同粒度的硅胶基质色谱柱比较，多孔聚合物柱的缺点是柱效低。塔板数一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半。 （3）其它无机填料
未衍生化的石墨碳正逐步被接纳为反相色谱柱的填料，已经制得具各种粒度的多孔小球。
小孔与大孔的氧化铝也可用于HPLC。 氧化铝基质的填料也可用于HPLC。 2.2 色谱柱的构型
大多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处理的直不锈钢管，用收缩接头将其与HPLC仪器连接。多孔烧结物（滤片）封闭色谱柱的两头，固定住填料微粒。一般来说，5μm与3μm的微粒分别用2μm与0.5μm孔径的不锈钢滤片。 径向加压柱。
卡套柱。
建立分析方法通常用内径0.46或0.3cm、粒度3~10μm的色谱柱最好。5μm微粒的色谱柱通常可兼容理想柱效、重现性与可靠性。3μm微粒的色谱柱能快速分离或柱效较高。然而，3μm柱的常见问题是它们可能更易发生堵塞，大大降低了色谱柱的寿命。 2.3 固定相 （1）键合硅胶
硅胶基质的反相填料一般通过在担体表面上共价键合有机硅烷或沉积聚合物有机涂层。 （2）其它固定相
（3）RP-HPLC中键合相保留行为
键合相填料的有机物含量（如百分含碳量）大致能说明一特定色谱柱的保留能力。键合相担体的表面积是一主要因素；表面积越大，保留值（k）就越大。对于仅为疏水作用的分离，只要其有机配位体能完全接近溶质，保留值随含碳量的增加而增加。
样品保留值一般随键合碳链长度而增加（C18＞C8＞C3＞C1），但长链之间的差别并不大（即C8≈C18）。通过选择键合相，可将样品保留值控制在一定范围内，但保留值的变化也会随色谱柱填料的表面积与所在硅胶担体类型的改变而改变。 （4）键合相色谱柱的稳定性
在相同条件下应用时，长链的烷基键合相填料（如C18与C8）一般比短链的键合相更稳定。
硅胶基质键合相柱的稳定性（与寿命）与硅胶担体与键合相的类型有直接关系。色谱柱稳定性也很大程度上取决于流动相的pH、所用缓冲液与有机改性剂的种类。硅烷键合相的损失归咎于将硅烷键合于担体上的Si-O-Si键的水解，在高温、低pH及水比例高的流动相中，离解加剧，而这些又是对许多样品分离较好的条件。
改善硅烷固定相在低pH时稳定性的另一种办法是使用空间保护官能团。
由于硅胶担体的快速溶解和由此产生的色谱柱床塌陷，有些硅胶基质的色谱柱不应在pH＞8时使用。
柱填料封尾可减少硅胶基质色谱柱在中等与高pH下的降解。 2.4 保留值与选择性变化的原因
官能团相同（如C18、C8等），由键合相色谱柱的不同引起保留值与选择性变化的原因有：
（1）硅胶担体不同；（2）硅烷的选择：单官能团或多官能团；（3）键合的彻底性：部分或全反应；（4）是否封尾；（5）键合化学；（6）担体表面积。
不同厂家的同种色谱柱（如C18）很少得到相同的分离。 RP-HPLC中有用的柱填料：
C18（十八烷基或ODS） 普适性好，保留性强，用途广 C8（辛基） 与C18相似，但保留值稍小 C3，C4 保留值小，大多用于肽类与蛋白质 C1（三甲基硅烷，TMS） 保留值最小，最不稳定
苯基，苯乙基 保留值适中，选择性有所不同 CN（氰基） 保留值适中，正相和反相均可使用 NH2（氨基） 保留性弱，用于烃类，欠稳定 聚苯乙烯基 在1＜pH＜13的流动相中稳定，对某些分离峰形好，柱寿命长 3，色谱柱的性能指标
使用色谱柱的类型和构型（粒度、长度、内径等）通常由分离的要求决定。
色谱柱的有关要求包括：某指定k值的塔板数N；峰不对称因子（As）；两种不同溶质的选择性（α）；色谱柱的反压；保留值（k）的重现性；键合相浓度（是否合适）；色谱柱的稳定性。 3.1 理论塔板数
塔板数（N）是色谱柱的一个重要特性。N定义为产生尖锐、窄谱峰，以及小α值时色谱峰达到良好分离度的能力。 L—柱长；dp—微粒直径
对于现有HPLC方法，新柱的塔板数常用特定的样品化合物，用标准（规定的）分离条件进行测定。由于色谱柱塔板数取决于具体的实验条件，所以具体测定化合物的塔板数可能会小于在优化条件下测定的中性小分子溶质的最佳值。当溶质分子较大或流动相粘度较高时，N值可能为最佳值的一半或三分之一。有些溶质的二次保留（由于硅羟基作用）也能引起峰展宽与塔板数小于期望值。 3.2 峰不对称与拖尾
峰不对称能导致：（1）塔板数与分离度测定不准；（2）定量不准确；（3）分离度降低与峰尾中的小峰检不出；（4）保留值的重现性不好。 实际工作中用峰不对称因子（As）表示峰形，计算如下：峰不对称因子=B/A，（A，B分别对应整个峰高10%处两边的距离）。
理想柱的峰As值为0.95~1.1，生产厂家有时规定新柱As值为0.95~1.3，被测样品的As值一般应＜1.5。 3.3 色谱柱失效：色谱柱寿命应有多长？
色谱柱的稳定性与使用寿命，取决于操作者对色谱柱的使用与处理。所有色谱柱最终必然“失效”，当柱不能保证特殊样品所需的性能时，则应更换新柱。一支性能有所降低的色谱柱，对某种分析可能仍然有用。峰不对称值As增大至＞1.5，也可能是更换新柱的信号。 色谱柱使用多长时间应更换，与注入样品的类型关系很大。一般干净样品，每支色谱柱正常分析次数为1000~2000次。对更复杂和脏样品，或那些临界分析条件的样品，每支柱的正常分析次数为200~500次。 3.4 保留值的重现性
不同色谱柱之间的保留时间或k值的是现性，可通过测定一系列的标准样品来决定，最好极性与非极性的分子都包括。
色谱柱厂家往往通过一个试验，评价原色谱柱的性能。在用户实验室中可定期地重复该试验，以确定不同色谱柱之间的保留性能或应用期间每支柱的性能。 3.5 压力降
当使用的操作条件、色谱柱尺寸和微粒粒度相同时，填充良好的色谱
柱的渗透性或反压力也应该相似。用球状微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算： psi
3.6 键合相浓度（覆盖率）
制作良好的硅胶键合相是在硅胶担体表面致密覆盖有机基团。实际覆盖率取决于有机配位体的大小：由于空间阻碍，硅烷基团如果较大，则难以达到较高的表面浓度。完全（致密）键合填料的表面浓度（每平方填料表面键合相的微摩尔数）随烷基基团而不同。
用表面完全反应的色谱柱填料，可能会得到较好的柱间保留重现性和柱寿命。
4，色谱柱问题与解决方案 4.1 保留值与分离度重现性不好
当建立常规方法时，色谱图中峰的保留值与分离度的重现性极为重要。如果每次分析的样品保留值不能重现，则不能肯定改变条件会使分离改善。
整个分离过程中，k和α值的变化不应超过2~3%。分离度的变化（由k、N或α变化引起的）与下面变化有关：（1）色谱柱与其操作条件；（2）仪器影响；（3）分离条件。 HPLC中保留值与分离度的变化原因
现象 原因 主要变化
柱间差异 担体、键合的不同 k、α
减小保留 增大保留
提高柱极性（氰基、C4） 降低柱极性（C8、C18） 降低流动相极性 提高流动相极性 （提高%B-增加有机溶剂） （降低%B-增加水） 提高温度 降低温度 2.1 流动相的影响
通过改变流动相组成或溶剂强度调整保留值（k值）较好。在RPC中，采用弱极性的强流动相时溶质保留值较小。溶剂强度取决于所选用的有机溶剂和其在流动相中的浓度：%B，一般A代表水，B代表有机溶剂。
（1） %B的选择
方法建立的有效步骤是先以极强的流动相开始试验（如100?N）。使用强流动相有可能使首次的运行时间很短，强保留化合物可全部流出。然后逐渐降低%B，使其0.5＜k＜20，k与%B之间基本呈线性关系：
式中：kw是仅以水为流动相（0%B）的理论k值，S对特定组分为常数（S≈4）， 是有机溶剂在流动相中的体积分数（%B）。 每减少10%的B相，k值约增大2~3倍。3倍规则对于快速估算所有样品组分的保留值均可接受时的最佳B值非常有用。 （2）流动相强度
RPC中的流动相强度由%B和有机溶剂种类共同决定。
溶剂强度顺序为：水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最强）。可见溶剂强度随着溶剂极性的降低而增加。 乙腈（ACN）是流动相有机溶剂的最佳首选。第二是甲醇（MeOH），第三是四氢呋喃（THF）。 2.2 色谱柱和柱温的影响
RPC分离通常使用硅胶基质的键合相柱。样品保留值由色谱柱的三个特性决定：柱类型、键合相浓度和柱表面积。保留值通常随键合相链长的增加而增大。
k值与柱表面积成正比。因此，大孔隙（表面积低）的氰基柱很弱，其保留值大大低于小孔隙（表面积大）的C18柱。
对于非离子样品，通常柱温增加1℃，k会减少1~2%，因此可通过改变温度来控制样品保留值（k范围），这与改变%B类似。但这种方法在RPC中并不常用，因为改变溶剂强度更加有效。 3，反相色谱的选择性
调整样品保留值k的范围仅是获得充分分离的第一步。当整体保留值令人满意时（即0.5＜k＜20），可能有必要改善不同谱峰的峰间距或选择（α）。RPC中用来改变中性样品选择性的主要参数有三个：流动相组成、柱类型和柱温，其中改变流动相组成通常最为有效且方便，故应首先考虑。 3.1 溶剂强度的选择性
降低%B的主要影响是导致各样品组分的k值增加。
当%B的改变使某峰对的分离度增加而另一峰对的分离度降低时，关
键峰对的归属也将发生变化。最佳样品分离度的理想%B值是两峰对的分离度相同。
一般来说，%B值有一个合适的范围，使样品中各组分均获得可接受的k值。在此范围中，特定的流动相组分（%B）能使整体样品分离度最佳。最佳溶剂强度（%B）的选择可通过试-凑试验获得。 3.2 溶剂类型选择性
改变有机溶剂类型来改变峰间距与改善分离度是一种常用的方法。按照溶质会影响选择性的那些特征（包括酸性、碱性、偶极性等）选用不同的RPC溶剂（溶剂选择性三角形）。
优化选择性时，除ACN、MeOH和THF外，有时也使用二氧六环、丙醇、二甲亚砜、2-甲氧乙醇等。
在RPC中，改变溶剂类型通常是改变选择性、分离多组分中性样品最有效的措施。因此，在建立复杂样品的反相分离方法时，调节流动相中有机溶剂种类和浓度应作为一种主要手段。 3.3 柱类型对选择性的影响 改变类柱型可改变选择性。
改变色谱柱通常不如改变流动相类型效果明显，因此，只有在调整溶剂强度或溶剂类型改变选择性不成功时，才尝试改变柱类型来改善选择性与分离。
如果改变色谱柱，必须针对新柱重新优化流动相。
氰基、苯基与C8或C18柱的选择性差异很大。通常应先试验C8或C18柱，然后再试氰基柱、苯基柱。
3.4 温度对选择性的影响
采用RPC分离中性化合物时，k值通常随着柱温升高而降低。大多数情况下，改变柱温对改变非离子化合物的选择性，进而改变分离的效果不大。
4，反相色谱中非离子样品分离条件的优化 4.1 开始
建立RPC方法必须兼顾分离度、运行时间和柱压。15或25cm、5μm C8或C18柱为首选，以未经缓冲pH的ACN-水为流动相。流速1~2mL/min。柱温应控制在35~45℃之间，如果开始不知道UV检测的最佳波长，在210nm检测可能是最佳首选。 反相方法建立的推荐步骤：
（1）调整%B，使0.5＜k＜20(1＜k＜10更好) （2）检查峰拖尾或塔板数低的现象 （3）如必要,调整选择性 a，微调%B b，改变有机溶剂 c，混合有机溶剂 d，改变柱类型 e，改变温度
（4）优化柱条件(柱长、颗粒尺寸、流速) 4.2 优化选择性
使样品保留值范围合适的?N确定之后，可能有必要调整选择性以
改变分离（即：使运行时间更短或分离度更佳）。 改善选择性的方法：
（1）改变溶剂强度：优点：简单方便，在0.5＜k＜20范围内通过改变%B寻找合适的α
缺点：当k＞20时不如改变溶剂有效，尤其对于等度洗脱时k末峰?k首峰的样品
（2）改变溶剂类型（ACN、MeOH、THF）：优点：当仅改变%B不足时，改变α值的有效
办法（α值的变化可能比仅改变%B要大） 缺点：由于需要更多的实验，故不如改变%B方便
（3）混合不同溶剂：优点：分离一对以上的关键峰对时，可提供中间选择性；扩展了改变 溶剂类型的应用范围 缺点：需大量实验—不方便
（4）改变柱类型：优点：在改变选择性方面与改变%B的效果相当。当仅有一种溶剂类型
（如ACN）可用时，改变柱型则非常有用
缺点：不方便，因为必须安装新柱，并需重新平衡。将不同类型色谱柱串联起来使用，
以获得中间选择性的实用价值不大（而混合溶剂则较好） （5）改变柱温：优点：如柱温可控制，则非常方便 缺点：α随柱温的变化通常小于其它条件