山东大学实验报告 2016年 11 月 28 日
姓名 系年级 学号 科目 遗传学实验 题目 大蒜根尖诱导微核实验 组别 周三
诱变物质的微核检测技术
摘要 微核体检测是一种对环境中诱变物质进行评估的快速而简便的方法，被广泛应用于很多行业。此次实验，利用自主选定的化学制剂培养大蒜根尖，后通过观察根尖中的微核体来检测此试剂的诱变能力，了解了微核检测的方法和意义，掌握了一项评价环境中常见物质诱变情况的技术。
1. 引言
微核是细胞在间期时，染色体发生断裂，在进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的、与主核分开的微小核，主要由外界损害因素（生物、物理、化学因素）对细胞的作用形成的。
19世纪末，Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howell-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。这一小体便是今日被称之为微核的小体。
1959年，Evans等将蚕豆根端细胞暴露在电离辐射下，观察到辐射诱导微核形成效应，并据此间接推断微核来源于辐射诱导的染色体异常。这篇文献便是以微核发生率反映染色体异常来评价遗传毒性的第一篇报道。作者认为约60%染色体断片与微核形成直接相关。
1970，年Boiler和Sehmid以中国金黄地鼠为材料，观察了抗肿瘤药三亚胺给予后，骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中的微核发生率来作为微核试验的基本指标，并正式命名为微核实验。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑似有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后至70年代中期，Sehmid以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了微核实验的理论及应用基础。
近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，微核实验的重要性也就随之突显出来。
微核实验技术简单易行且灵敏，目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面
2. 实验材料及方法
2.1 实验材料
2.1.1试验材料
大蒜。 2.1.2实验器具
显微镜一台，双筒体视显微镜一台；
解剖针两根，眼科镊，载玻片，盖玻片（20mm×20mm），滤纸条，解剖刀片。 2.1.3实验试剂
改良苯酚品红，1mol/LHCl，蒸馏水，卡诺氏固定液， 酒，烟水，过期花露水，指甲油溶液，叠氮化钠。 2.2 实验方法
2.2.1 材料的获取
将大蒜（选取可生根成熟未经农药处理的大蒜）浸泡水中，于24发根至0.5~1cm（约24~36h），选择
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根长整齐一致大蒜随机分组。 2.2.2 处理各实验组
实验组：适当浓度的酒，烟水，过期花露水，指甲油溶液； 阳性对照组：0.05M NaN3溶液； 阴性对照组：蒸馏水；
将发根至0.5~1cm的大蒜随机分为6组，分别浸泡于上述溶液中，于24℃继续培养24h（一般植物生长周期17~18h）。 2.2.3 恢复培养
将材料移入蒸馏水中，于24℃恒温培养箱中继续培养24h。 2.2.4 材料的固定及保存
将各组大蒜根尖剪下，分别于卡诺氏固定液中室温固定24h。之后转入75%酒精中4℃保存 2.2.5 制片及观察
①根尖用1MHCl处理的10min，蒸馏水洗涤3次。
②切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10~15min。 ③压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。
④镜检：先用低倍镜进行观察，找到好的视野后再转用高倍镜观察。每个根尖计数100个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。
3. 结果
3.1 培养样品图示
酒水 指甲油 3.2 实验结果统计 组别 微核率（‰）
阴性对照组 （清水）
0
酒
烟水 水 过期花露水 叠氮化钠 烟水
过期花露水 0
指甲油
阳性对照组 （0.05M NaN3）
42%
0 0 0
3.3 实验结果图示
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山东大学实验报告 2016年 11 月 28 日
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微核体 细胞核 大蒜根尖伸长区细胞
图1 微核形态图
图2 叠氮化钠处理根尖制片
4.讨论
4.1 结果分析
观察装片可知，阳性对照的微核数最多，诱变能力最强。此外很遗憾的是，阴性对照和我们的实验组都没有观察到微核，表示这些材料没有诱变能力，是安全的。
微核是由有有丝分裂过程中的染色体断片，或丝分裂后期丧失着丝粒的染色体产生的，这些染色体可以使一条，几条染色体也能形成微核。这些断片或脱离的染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，当子细胞进入下一个分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成了微核。
环境中有很多物质可能会诱导癌变，所以我们选取了烟，酒等物品尝试进行诱变，从大蒜的涨势来看，说明这些物质并不会抑制大蒜生长，而且没有成功诱导微核说明小剂量的这些物质并不会诱导癌变对人体产生坏的影响。
我们对根尖进行压片观察时，压片效果不是很好，对微核率造成影响，有些细胞重叠在一起使微核的观察和计数比较困难，在下次实验中应该注意。 4.2 注意事项
1. 微核的判定标准：
①凡主核大小的三分之一以下的小核； ②小核着色不论深浅；
③小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；
④小核可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓楞楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心当作微核计入。
2.应选取对诱变因子敏感的材料进行实验，否则实验效果不理想。
3. 切取根尖时要准确，若切取组织过大，制片后视野中细胞过多，且多层，影响观察；若过小，则丢失细胞。两种情况都会造成观察到微核偏少的现象。
4. 在解离之前和之后，均要用清水洗涤根尖，否则前者影响解离，后者影响染色。
5. 若诱变因子浓度较低，则微核较少；压片时可能压入杂质，染液也可能产生沉淀，所以在压片之后需要认真地进行镜检，不漏掉一个微核，也不把杂质误认为微核。
⒍压片时不可用力过大，压碎细胞核，影响观察及计数。
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