RBC膜蛋白质分离提取及定量，β-actin western blot鉴定
分组：10人+/大组，每大组一套电泳装置，实验完毕清点后，交回带教教师。
损坏需赔偿！！ 由大组组长分小组：
膜提取、蛋白质定量测定（Lowry法）3-4人/组、凝胶板制备
一、RBC膜蛋白提取制备 （由教研室老师完成）
15 ml RBC液 2000rpm 5分钟
沉淀＋ 3 Vol等渗buffer 2000rpm 5分钟 ×2 沉淀＋低渗buffer （>1:50 ）
（用1000ml烧杯） 置冰箱过夜 将上清弃去，保留膜沉淀
周日8:00am开始 至 下午 8：00pm 二、RBC膜洗涤：离心注意平衡！！！
RBC膜沉淀转至1.5ml塑料离心管中，每大组2个左右（后缩为1个）
9000rpm 5分钟 沉淀＋ 低渗buffer 1ml， 滴管吹打
9000rpm 5分钟 × 4
沉淀 ＋等渗buffer 1ml，合并为1管，吹打
9000rpm 5分钟
沉淀＋0.6ml等渗buffer （即为膜提取原液）
*此步骤离心时，
可准备灌胶
三、样品处理：一大组
（1）电泳样品处理
0.3ml原液＋0.3ml样品溶解液，沸水浴5分钟
取18ul/孔 SDS-PAGE上样 （2）Lowry法测定样品处理
A液：0.3ml原液＋1.5ml H2O＋150ul NaOH
沸水浴5分钟，摇匀 取A液100ul ＋900 ul H2O―――待测管1
A液300ul ＋700 ul H2O―― 待测管2 3-4人/小组
四、lowry法测定膜蛋白含量
按照讲义P 7-8 方法，用分光光度计测定。
五、SDS－PAGE 测定蛋白质分子量 （先操作三、四做）
（一） 垂直玻璃板安装（必需先固定好凝胶板再配凝胶！！）
每大组装两套板，注意每套两块板下端对齐，置于灌胶架上。
（二） 凝胶制备按PPt上表，在小烧杯中配置凝胶 30％凝胶储备液 蒸馏水 1.5mol/L Tris-HCl Buffer 1mol/L Tris-HCl Buffer 10％SDS 10％ 过硫酸铵 TEMED 10％分离胶 10ml 3.3 4.0 2.5 0.1 0.06(60ul) 8ul 5％浓缩胶 ml 1.0 4.0 1.0 0.08 0.06(60ul) 8ul 注意：加入过硫酸铵、TEMED后即刻灌胶，三~五秒后轻轻沿板壁加入蒸馏水2cm左右。
1.配制分离胶 10％ 每块板约为4ml
可以先用齿梳试一下，灌胶至距离齿梳一厘米处（直接倒入板内，不需用滴管） 1小时左右凝固，去上层水（注意不要碰到胶面） 2．配制浓缩（积层）胶
灌胶后，将齿梳放入（现放一端，慢慢压下另一端），余凝胶用加样器补充溢出凝胶。 1小时左右凝固，小心取出齿梳。注意：未凝固前溶液是有毒的！！
（三） 电泳装置安装
至灌胶架上取出凝胶板，固定于电泳内槽上，小心夹紧（注意玻璃板卡住内槽上胶条接口）。用电泳Buffer加入内槽，要求无渗漏。
将内槽放入外槽中，加buffer至刻度（约需1L） 加样
18ul/孔 注意一次加入，不要反复抽吸。每板留中间处一孔加蛋白质标准品8ul。
（四） 接通电源，检查正确接好正负极。
100V 示踪染料进入分离胶，调至80V， 待示踪染料电泳至距离下端1cm，可停止电泳。（约1.5小时）
（五） 取（剥）胶（注意：一块胶染色，一块胶作半干转移！！）
1． 半干转移
用专用塑料板轻轻推（撬）开玻璃板，将胶块浸入转移Buffer(滤纸，膜)中，20分钟。
2. 染色及脱染
用专用塑料板轻轻推（撬）开玻璃板，将一块胶块推入染色液平皿中，染色2小时后，吸去染色液，进入7％乙酸中脱色，换液。脱洗至条带清晰。
（六） 蛋白质分子量计算
a) 测量迁移距离，计算标准品中蛋白质（MW<70KD）MR b) 样品中选择3种条带测量迁移距离，计算MR c) 作半对数曲线
d) 计算待测样品蛋白质分子量
标准蛋白 标准蛋标准蛋白待测样品 待测样品 待测样品 MW 白迁移MR 迁移距离MR MW (KD) 距离cm cm 70 55 40 35 25 15
六、western blotting(β-actin鉴定)
1.转膜
将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的PVDF膜、滤纸均浸入转移Buffer中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置：阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端
用玻棒滚动去除空气气泡，电转本实验采用20V 20分钟。
注意：转膜后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，膜干燥则极易产生较高的背景。尽量减少直接用手接触，手套应用无滑石粉的，如有清洗后接触膜。
2.封闭(Blocking)
转膜毕，即将膜放至预先准备好的TBST中，漂洗5分钟，以洗去膜上的转膜液。用水泵或滴管吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭10分钟。
取出膜放入TBST洗膜3次，5分钟/次（小平皿中）。 根据预染marker判定蛋白转移完全否（照相保留）
3.一抗孵育
用水泵或滴管等吸尽封闭液，加入稀释好的一抗(1:250)，室温在摇床上缓慢摇动孵育1小时。 取出膜放入TBST中洗涤，在摇床上缓慢摇动洗涤5分钟/次。洗3次。
4. 二抗孵育
用泵或滴管等吸尽洗涤液，加入稀释好的二抗（1:200），室温摇床缓慢摇动孵育1小时。 取出膜放入TBST中洗涤，在摇床上缓慢摇动洗涤5分钟/次。洗3次 5. DAB显色
A、B、C各一滴加入1ml 水中混匀。加至标本上，一般显色10分钟左右 蒸馏水充分洗涤以终止反应。
显色剂A：DAB;显色剂B：H2O2;显色剂C TBS 6.结果保留：
将显色后膜条进行扫描,并打印结果。
注意：因为抗体昂贵，所以，每个班放在一块膜上（三块胶）进行转膜，及转膜后鉴定