5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。
离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。 如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在约pH3~4时），随后是中性氨基酸，如glycine和alanine。碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。 树脂材质：
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 根据交换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂。 1. 阳离子交换树脂
分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 2. 阴离子交换树脂
分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ －N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有
强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。
除了树脂以外，纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（Sepharose）也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质 。
实验证明，纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好，因为离子交换纤维的种类多，能依据不同分离目的使用，且功能团基主要在表面，对生物大分子的交换十分有利。 离子交换剂的选择：
离子交换剂的选择，首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱。 1. 阴阳离子交换剂的选择
若被分离物质带正电荷，例如polymyxin、 cytochrome C这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像heparin、nucleic acid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（iulin）为例，它的等电点为pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用阳离子交换剂，在pH>5.3的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。
简而言之，已知等电点的物质，在高于等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的pH下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定pH条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。 2. 缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的p
K值。使用阴离子交换纤维时要选用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的pH值。
缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。 离子交换树脂的前处理：
离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质 ，并以NaOH和HCl处理树脂，使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以15倍于树脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分钟，同样以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用15倍于树脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分钟，以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。 亲和层析（affinity chromatograph)
亲和层析也称为功能层析（function chromatography）、生物专一吸附（bioecific adsorption）或是选择层析（selective chromatography）。所谓的亲和力，即生物大分子和其配体（ligand）之间形成可逆结合的能力，如酵素和它的底物（sutrate）、抗体和抗原、激素和受体（receptor）、RNA和其互补的DNA等，亲和层析就是根据这种亲和力发展出来的纯化方法，例如将酶的sutrate接在固体支持物上，再用此支持物填装管柱，当含有这种酶的样品溶液通过管柱时，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白质及杂质不被吸附，全部从层析柱流出，最后使用适当的缓冲液，将欲分离的酶从柱中洗出来，经过这些步骤便能得到纯化的酶。 材质选择：
要进行亲和层析，ligand的选择相当重要，ligand可以是辅酶、酶的抑制剂或抗体，具
备的条件如下：
1. 能与要分离的物质进行专一性的结合，亲和力愈大愈好。
2. Ligand与分子结合后，在一定的条件下又能解离，而且不会因解离破坏原本的生物活性。
3. Ligand上具有能连结到固体支持物上的团基，结合后不影响它与欲分离物质的结合专一性。
在实际操作上，若要纯化的是某一种酶，则lignad选用此酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶或是效应剂（effector ）；若是要纯化酶的抑制剂，就选用此酶作为ligand；纯化能与某维生素结合的蛋白质，可以使用这种维生素当ligand；纯化激素的受体（receptor），选用激素当ligand。纯化核酸可利用核酸与蛋白质的交互作用、DNA之间的互补关系、DNA与RNA的hybridization，运用适当的ligand。
亲和层析中与ligand连接的支持物多为凝胶，凝胶应具备以下条件： 1. 不溶于水，但具有亲水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分离物。 2. 化学惰性，没有（或极少）离子交换这一类非专一性的结合。 3. 具有足够的化学团基，经活化后能与大量的ligand结合。 4. 最好是均一的球状颗粒，制成的管柱才能有较佳的流速。 5. 具有多孔网状结构，方便大分子自由通过。
6. 物理及化学性质稳定，不因洗出时改变的各种pH值、离子浓度、温度或界面活性剂而改变其结构。
亲和层析法使用的支持物种类，部份与胶体过滤法重复，除了Polydextran、Polyacrylamide、Agarose以外，Ultrogel是能承受较大压力的凝胶，流速高；cellulose 主要用于亲
和免疫层析，但它有非专一性吸附的性质；Bio-gla是硼硅酸钠经高温和酸碱处理制成的多孔玻璃，质地硬、强度高、孔径均匀、不怕微生物侵袭，但缺点和cellulose一样，它的表面对蛋白质也有非专一性吸附。 样品的分离：
要使要分离的物质与ligand分离，通常采用改变pH、离子浓度或缓冲液的组成，使其亲和力降低，有时使用0.1M醋酸或0.1M 氢氧化钠冲洗，就能得到不错的效果。如果纯化对象与ligand的亲和力不强，当连续通过大量的平衡缓冲液，就能在杂质洗出后，得到所要的物质；若亲和力较强，则要使用较强的酸或碱作为冲洗液，或是添加guanidine hydrochloride，但这些溶液容易使纯化对象失去生物活性；用较高浓度的ligand溶液亦可将管柱上所吸附的物质洗出，此ligand可以与管柱上的相同或相异。
对于亲和力小的物质，上柱的样品最好是体积小而浓度高，粘度较大的溶液，可以将一定量的ligand加到待分离的溶液中，搅拌平衡一段时间，进行过滤或离心，最后进行洗出的步骤。由于生物大分子和其ligand间达到反应平衡的速度很慢，样品上柱的流速要尽量慢；通常亲和力会随温度增高而降低，其中一例是将乳酸脱氢酶从管柱上的AMP洗下来时，所需的NADH浓度随温度增高而减少，在摄氏零度到十度间的变化尤其明显，因此如果待分离的物质在摄氏4度可被紧密吸附，在摄氏25度以上容易被洗下来，则可在4度环境下进行亲和吸附，在25度以上的环境进行洗出的步骤。
说到经典的亲和层析柱，当然要提到GE公司的王牌产品Ni Sepharose High Performance填料，Ni Sepharose分有许多不同的凝胶类型，主要是根据凝胶颗粒的大小来区分，这些镍琼脂糖凝胶产品受到广大科研工作者的欢迎，但基本上都是以层析系统或者散包装出售的。所以要提一下一款His inTrap，His inTrap只需使用一台标准的小型离心机就可以完成纯化步骤。过程也就是将均一、澄清的细胞裂解物加入到柱子中就可以直接进行纯化，样品无需离心或过滤处理。所以说His inTrap省去了烦杂的样品制备时间，节省了研究人员的劳动力，每10分钟就可以进行一次小型纯化。因为纯化的时间变短，使样品降解或者氧