题 目 麦草畏及2,4-D对西洋参体细胞胚胎发生比较研究 学生姓名 胡云杰 学号 1112014043 所在学院 生物科学与工程学院 专业班级 生物科学专业11级02班 指导教师 曹小勇 完成地点 资源生物重点实验室组织培养室
2015年 6月8日
陕西理工学院毕业论文
麦草畏及2,4-D对西洋参体细胞胚胎发生比较研究
作者:胡云杰
（陕西理工学院 生物科学与工程学院 生物科学1102班，陕西汉中 723000）
指导教师：曹小勇
[摘要] 本研究以西洋参成熟种胚为材料，以MS培养基为基础培养基，附加(0.05-2)mg/L麦草畏，0.5mg/L
2,4-D以及0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L麦草畏组成八组培养基，对西洋参成熟种胚进行离体培养。评价麦草畏对体细胞胚胎发生的影响，确定麦草畏在西洋参体细胞胚胎发生中的作用，为西洋参快繁积累相关资料。材料培养40天后，在MS培养基上未形成愈伤组织及胚状体；在附加不同浓度麦草畏的培养基上，都能诱导出愈伤组织和胚状体，其中1mg/L麦草畏的效果最佳，愈伤率为94.34%，胚状体发生率为56.60%；在添加0.5mg/L 2,4-D的培养基上愈伤组织和胚状体发生率均为100%；在添加0.5 mg/L麦草畏和0.5 mg/L 2,4-D的混合培养基上，愈伤组织和胚状体发生率分别为95%,80%。实验结果表明，麦草畏可以诱导西洋参成熟种胚形成愈伤组织和胚状体，其中1mg/L麦草畏的诱导效果最佳，但是效果不及2,4-D，在与2,4-D混合使用时对比2,4-D单独使用的效果也有所降低。
[关键词] 西洋参；麦草畏；体细胞胚
引言
西洋参（American ginseng）又名花旗参、美国参，系五加科人参属多年生草本植物，原产于美国和加拿大。它含有多种生理活性物质，如西洋参皂苷、多糖、黄酮类、挥发油、微量元素等，其中属西洋参皂苷的生理活性最为显著。西洋参还具有镇静镇惊、安神促智、抗心律失常、抗休克、保护心肌、防血管硬塞、降血脂、增强机体免疫功能、抗应激、抗肿瘤、保肝的药理作用。我国自1975年10月开始有计划地引种西洋参，目前已形成了四大生态气候栽培区：东北栽培区、华北栽培区、华中栽培区和康滇栽培区。隶属于华中栽培区的陕西汉中地区从1978年引种栽培，获得成功[1-2]
。西洋参生长缓慢,对生长环境要求严格，栽培技术复杂，存在种胚后熟现象，在自然状态下需
[3]
要长达20-22个月才能打破休眠，常规育种方法很难满足生产上的需求。到目前为止人们在西洋参的组织培养及体细胞胚胎发生方面已经做了较为深入和系统的研究，但至今尚未确立稳定的西洋
[4]
参快速繁殖体系。如果与常规育种方法相结合，通过离体培养技术，建立体细胞胚胎发生的无性
[5]
繁殖系，在细胞和组织水平上进行抗病等抗性育种，就可以缩短育种年限，加快育种进程。 目前研究发现，西洋参胚状体的诱导发生主要存在两种方式：①直接在外植体上发生；②先产生愈伤组织，愈伤组织再分化形成。西洋参组织在离体培养的条件上也可直接发生胚状体，但相关报道较少。关于西洋参愈伤组织诱导出胚状体的报导很多，西洋参的种胚、根髓、成熟根、叶片、
[6]
子叶、上胚轴，胚轴来源的愈伤组织均能诱导出胚状体。Wang用西洋参根外植体在附加2,4-D(2mg/L)
[7]
和KT(1mg/L)的培养基上，诱导形成胚性愈伤组织。Tirajoh 以西洋参三种外植体(根、上胚轴)研究附加不同生长调节物的MS培养基上体细胞胚胎的发生。体细胞胚胎形成平均为：根 15.6％(3个月后)，上胚轴 2％(6个月后)，由于这些胚萌发形成茎但没有形成根，因此未能形成完整植株。
[8]
Zhou等建立了西洋参有效的离体生产方法；对子叶外植体用1.0M蔗糖4℃下进行预处理，改善胚的质量，结合诱导培养基中高蔗糖含量(7%)，胚胎发生的频率由40% 提高75%，而每个外植体胚胎发生数量由10个提高到21个。胚性愈伤组织在含有生长素的培养基上继代培养时，可继续增殖并
[9]
不断分化出胚状体。在愈伤组织上形成的胚状体，如不及时转移亦可愈伤组织化而再生成胚状体。2,4-D和NAA是诱导西洋参胚状体发生的有效植物生长调节物质，与大多数植物组织培养中要求降
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低生长素浓度以诱导愈伤组织和胚状体发生的情况一样，西洋参对生长素，特别是2,4-D的浓度有
[10,11]
较高要求，不仅诱导愈伤组织需要，而且胚状体发生时也需要。 麦草畏(Dicamba)是一种除草剂，其结构和作用类似于2,4-D，其在提高愈伤组织诱导率和胚性
[12] [13]
愈伤组织诱导率方面具有一定作用。戚家华等用小麦花药进行离体培养时，在添加1mg/L麦草畏的培养基上，发现诱导愈伤的效果要优于对照CK。并且在促使成苗时形成的苗多为丛苗，表明它促使胚状体形成的能力较强。还发现丛生苗能从根部不断产生新的愈伤组织，说明麦草畏在进入细
[12]
胞后能持续保持其诱导作用。李海霞等以不同品种玉米幼胚为材料，比较了2,4-D和麦草畏对诱导愈伤组织和继代的影响，结果表明，麦草畏对不同品种玉米幼胚的愈伤诱导效果均优于2,4-D。目前尚未见到麦草畏对西洋参体细胞胚胎发生影响的研究报道，但是根据现有研究可以发现其诱导愈伤的效果还是明显优于常用的2，4-D的，因此对麦草畏的进一步研究还是非常有必要的。
本研究以西洋参成熟种胚为材料，以2,4-D为对照，评价不同浓度麦草畏对体细胞胚胎发生影响，确定麦草畏在西洋参体细胞胚胎发生中的作用，为西洋参快繁积累相关资料。
1材料与方法
1.1 材料
本实验的研究材料为西洋参成熟种胚。于2014年11月初，经留坝县科技局中药办协助，从陕西省汉中市留坝县西洋参种植基地购得。经过沙藏层积处理，大部分种子已经出现裂口，但尚未发芽，如图1.1（a）。在无菌条件下，用解剖工具把西洋参种子解剖，取出种胚，将成熟种胚作为外植体材料。如图1.1(b)。
a
1.2 实验仪器、用具及试剂 1.2.1 仪器与设备
b
图1.1 外植体材料
SW-CJ-IF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、YXQ-IL-50高压蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SR-1607C型电磁炉（尚明堂电器有限公司）、FA-2004N型电子天平、Nikon SM2800体视显微镜、Nikon E600显微镜、SONYdsc-h3数码相机、培养架、冷藏冷冻箱等。 1.2.2 实验用具
酒精灯、锥形瓶、容量瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、胶头滴管、pH试纸、封口膜、广口瓶、镊子、解剖刀、解剖针、培养皿、陶瓷杯、称量瓶、滤纸等。 1.2.3 实验试剂
琼脂、 蔗糖、2,4-D、麦草畏、有机物、Fe盐、大量元素、微量元素、纯净水、NaOH（1.0mol/L）、HCl（1.0mol/L）、0.1%的升汞溶液、75%的酒精等。 1.3 方法
1.3.1愈伤组织和胚状体的诱导
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1.3.1.1种子消毒
在沙藏的容器中选取饱满已经裂口的种子，剥去种皮后，取实验材料置于纱网袋用洗涤剂清洗，自来水流水冲洗2个小时。带入超净工作台，75%酒精处理10s，再用0.1%升汞处理8min，进行表面灭菌，然后用无菌水漂洗4次，快速分装到无菌培养皿中。 1.3.1.2培养基
本实验以MS培养基为基本培养基, 添加3％蔗糖、0.6％琼脂，附加不同种类的植物激素（表
2
1.1），pH值为5.8，在121.0℃、1.1 kg/cm的高温高压下灭菌20min。 1.3.1.3接种
将上述准备好的种子切取其种胚，分别接种到八种培养基上，每瓶接种3-4个外植体。置于培养室中培养。 1.3.1.4培养条件
温度：25±1℃；光培养：光照强度1000～1500Lux，16h/d。
表1.1 培养基配方
培养基编号
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8#
MS
MS + 2,4-D（0.5mg/L） MS + 麦草畏(0.05mg/L) MS + 麦草畏(0.1mg/L ) MS + 麦草畏(0.5mg/L ) MS + 麦草畏( 1 mg/L ) MS + 麦草畏( 2 mg/L )
MS + 麦草畏(0.5mg/L)+ 2,4-D（0.5mg/L）
培养基配方
外植体材料 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚 成熟种胚
实验组 空白对照 2,4-D对照 实验组 实验组 实验组 实验组 实验组 实验组
1.3.2 观察与记录
定期观察，并做好数据统计。7天、10天、20天、40天时，对接种情况进行观察，发现有愈伤
组织或胚状体形成时，进行计数并做好记录。 1.3.3 实验参数的计算方法
愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数∕接种外植体数×100% 胚状体发生率 =产生胚状体的外植体数∕接种外植体数×100%
2 结果与分析
接种后7天观察发现各培养基中大部分子叶开始膨大、变绿，胚轴也有所增粗，并且发现培养基中有少量成熟种胚发生污染，其主要原因为灭菌不彻底和接种时细菌污染。10天后观察，发现各培养基中成熟种胚胚轴开始伸长，长出胚芽，并伴有少量褐化现象，但不明显。除了麦草畏浓度0.05mg/L和0.1mg/L的培养基上未发现愈伤外，其他浓度的培养基上均有一定量的种胚在子叶边缘和胚轴基部开始出愈。20天后2,4-D培养基中90%种胚出愈，麦草畏浓度（0.5-2）mg/L培养基中出愈率进一步提高，0.05mg/L和0.1mg/L培养基中仍未发现出愈。40天后观察，愈伤组织上有胚状体形成，且愈伤组织变大，质地变得疏松，胚状体变得明显，每个外植体上的胚状体数量增多。并且有观察到胚状体的两种发生方式：①直接在外植体上发生；②先产生愈伤组织，愈伤组织再分化形成（图f、g）。40天后西洋参成熟种胚愈伤组织和胚状体的形成情况统计表（表2.1）。
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表2.1西洋参成熟种胚培养40天后愈伤组织和胚状体发生情况
培养基编号
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8#
外植体个数
20 36 28 21 39 53 32 20
愈伤数 0 36 2 2 24 50 29 19
愈伤率 0 100 % 7.14% 9.5% 61.54% 94.34% 90.63% 95%
胚状体数
0 36 5 5 16 30 18 16
胚状体率
0 100 % 17.86% 23.81% 41.03% 56.60% 56.25% 80 %
a
b
c
d
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