G. 实时定量PCR方法： 建议：
? 实验中使用带滤芯的枪头以尽可能减少污染的可能性。
? 试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因，既可以用于常规PCR也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP样品来源于其它他物种，
建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。
? 建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。 ? PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计：
引物长度: 最佳Tm值： 最佳GC含量: 扩增片段长度：
实时定量PCR方法：
1. 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板
的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照做一系列稀释（不稀释，1：5，1：25，1：125），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。 2. 在每个反应管或孔（板上）中加入2 μl相应DNA模板。
3. 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。
试剂 无核酸酶的水 5 μM RPL30 引物 SYBR-Green反应体系 4. 按下面程序执行PCR：
a. b. c. d.
预变性 变性 退火及延伸：
重复第2及第3步，共40个循环
95°C 3 分钟 95°C 10 秒 60°C 30 秒
每个PCR反应（20 μl）所需体积 6 μl 2 μl 10 μl 24个核苷酸 60°C 50%
150-200 bp（用于常规PCR） 80-160 bp （用于实时定量PCR）
5. 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。