吉林化工学院环境与生物工程学院
微生物学实验报告
土壤微生物的分离、培养及鉴定
学生学号：10350106 学生姓名： 王慧 专业班级： 生技1001 指导教师： 谢莹
吉 林 化 工 学 院
Jilin Institute of Chemical Technology
吉林化工学院环境与生物工程学院水处理微生物学实验报告
土壤微生物的分离、培养及鉴定
王慧、王宇、邓赛、丛学琦
（环境与生物工程学院，生物技术1001）
摘要：利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属类群。 关键词：细菌、放线菌、霉菌、培养基的配制、高压灭菌。
1前言
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基用于霉菌的分离培养。
2材料与药品
2.1材料
土壤（选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g。）、天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸、无菌培养皿、无菌移液管、玻璃涂棒等。
2.2药品
牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4?7H2O、NaOH溶液（1mol/L）、无菌水、1％重铬酸钾。
3 实验方法
3.1 培养基的配制
3.1.1肉膏蛋白胨培养基的配制
1．培养基成分
牛肉膏 0. 3g
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蛋白胨 1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水 100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
3.1.2高氏一号培养基的配制
1．培养基成分
可溶性淀粉 20g KNO3 1g
NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 20g 水 1000mL pH 7.2～7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
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（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
3.1.3马丁氏培养基的配制 1．培养基成分
葡萄糖 10g 蛋白胨 5g K2HPO4 1g
MgSO4?7H2O 0.5g 琼脂 16g 水 1000mL
链霉素溶液（10000U/ml） 3.3mL（临用前加入）的
2．配制方法
（1）称量：称取培养基各成分的所需量。
（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（4）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （5）加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。
3.2微生物的分离
3.2.1细菌分离
1．制备土壤稀释液
称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3……10
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顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为2．涂布分离
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10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。
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用无菌移液管分别吸取上述10－7、10－6、10－5、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。
3．恒温培养
将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。 3.2.2放线菌分离
1．制备土壤稀释液
称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释
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度的土壤稀释液。
2．涂布分离
用无菌移液管分别吸取上述10－5、10－4、10－3、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
3．培养
将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。 3.2.3霉菌的分离
1．制备土壤稀释液
称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。
2．涂布分离
将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
3．培养
将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。
4 结果与讨论 菌体外观记录表 菌落特征形状 颜色 质地 表面光泽 与培养基结合程度 菌体形态 光泽 粗糙 不紧密 紧密 球状 杆状 名称 细菌 放线菌 圆形 白、黄 软 橘 圆形 乳白硬 色 - 4 -
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霉菌 丝状 绿、疏松 白、黄 不光泽 不紧密 长管状有菌丝 讨论：实验过程中注意无菌操作，培养时需将平板倒置。 参考文献 [1] 林先贵 《土壤微生物研究原理与方法》 高等教育出版社 2010-3年 [2] 陈坚，刘和，李秀芬等 《环境微生物实验技术》 2008年
[3] 布瑞德（美） 《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology）
1974年第八版、1986年第9版
[4] 沈萍、陈向东 《微生物学》（第2版），高等教育出版社 [5] 西尾道德 《土壤微生物基础知识》农业科技出版社
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