转录组测序

转录组测序

转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。

高通量转录组测序技术，无需了解物种基因信息，能够对任意物种进行转录组分析，并接测定每个转录本的片段序列，精确到单核苷酸的分辨率；动态达6个数量级，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本，以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的表达；被广泛的应用于转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。

转录组测序的优势

1 单次转录组测序实验即可提供全面的转录组信息 2 转录组测序无需预先知道任何序列信息 3 转录组测序提高了动态检测范围和灵敏度 4 转录组测序可提供转录本中序列变异信息

技术流程：

数据分析：

有参考基因组的转录组分析 1、测序数据质量评估

我们将测序得到的所有序列与目前常见物种进行大规模随机blast，检测可能的样品污染。 同时，我们对测序得到的序列进行深度和覆盖度的计算以评价序列质量。

2、Reads比对到基因组

我们将测序结果与参考基因组进行比对, 比对的reads 中mismatch 的数目可以根据客户需要进行分析, 并挑选出unique map的所有reads用于后续peak的分析。同时进行reads的基因定位，用于后续分析。

3、Reads在基因组上的分布 4、新转录本的寻找

在每个样本中，都有一部分mapping不上已注释基因， 但是能mapping上基因组上的reads,通过提取这些reads比对在基因组上的序列，利用同源预测或者denevo预测，从而预测一些新的转录本。

5、检测反义链转录本并注释

我们通过对符合转录本标准的reads进行大规模比对，挑选出潜在的反义链转录本。并对检测的反义链转录本进行功能注释。

6、转录本定量

对RNA-Seq结果中的基因进行基因定量，定量方法采用 reads per kilobase of exon per million mapped sequence reads (RPKM)反映表达量。

7、差异基因Annotation, Synonyms及ID转换

对挑选出的差异基因进行功能注释和绝大部分数据库的ID转换，并附上每个差异基因对应的大部分别名。

8、可变剪切预测

我们使用已发表的权威算法进行可变剪切的预测分析。 9、聚类分析 9.1 层次聚类

对样品进行聚类：为了全面的直观的展示样品之间的关系及差异情况，将表达基因做聚类分析（见下图）。我们分别对上调基因和下调基因以及所有差异基因进行聚类分析，从而更严格和准确的评价样品重复质量。图片中，每一行代表一个基因，每一列代表一个组织，红色代表基因表达量较高，绿色代表基因表达量较低。

对基因进行聚类：方法类似对样品进行聚类。

对样品基因进行双向聚类：将上述两种方法综合在一起。

差异基因聚类

9.2 K-Means聚类（表达模式聚类）

为了对各个时期的表达模式进行全面的了解，进行表达模式聚类。下图是某组表达模式图：

10、基因的COG/KOG功能分类

对基因功能进行COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins) 或

KOG(Eukaryotic Orthologous Groups of proteins)分类，通过COG分类可以对变化基因所调节的功能有直观和感性的认识，从而了解待研究因子对于生物功能的影响，并对后续生物学实验的进行提供指导作用。以下是某三个时期芯片的COG分类表格和柱状图。

COG

分析结果简表

COG

分析柱状图