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1. 制备路线 2. 制备工艺 2.1发酵
2.1.1.MISB-2培养基的组成及培养条件 2.1.2.MIIB-7培养基的组成
2.1.3.MFIB-14培养基的组成及培养条件 2.1.4.接种体的准备
2.1.5.菌种的生长或预发酵 2.1.6.发酵罐 2.2.分离提取
2.2.1.用转鼓真空过滤机过滤发酵液 2.2.2.吸附与洗脱 2.2.2.1.树脂吸附 2.2.2.2.树脂塔的洗脱 2.2.2.3.树脂再生 2.2.3.提取
2.2.3.1.第一次萃取 2.2.3.2.活性炭处理 2.2.3.3.第二次萃取 2.2.3.4.MIBK的精制
2.2.3.5.IRC 50-600L树脂的再生 2.2.3.6.塔内活性炭的更换 2.2.4.结晶
2.2.4.1.第一次结晶 2.2.4.2.第二次结晶 2.2.4.3.第三次结晶 3. 工艺流程图 4. 原材料来源
5. 三废初步治理方案 6. 参考文献
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克拉维酸钾生产工艺的研究资料及文献资料
1 制备路线
发酵液中的链霉菌棒状体通过发酵合成克拉维酸，属于胞外的次级代谢。通过一系列的步骤：结晶的固体从发酵液中游离出来；加入助滤剂，通过旋转真空过滤器过滤去除菌丝体；通过强阴离子交换树脂对滤液的吸附和洗脱；酸性条件下的液-液萃取，将活性组分萃取到有机相中；活性炭纯化；从有机相萃取到胺盐水相中；胺盐固体的结晶；胺盐的重结晶和钾盐的结晶得产品。
2 制备工艺 2.1
发酵
2.1.1. MISB-2培养基的组成及培养条件
MISB-2
*微量元素溶液 糊精 硫酸铵
磷酸氢二钾 硫酸镁 氯化钠 氯化钙 蒸馏水
pH 7.0 琼脂
将上述组分混匀，加入试管中，每支加10ml，用棉花塞塞住试管口。然后120℃灭菌20分钟。 斜面试管的接种完成以后，在温度28℃，相对湿度为40%的条件下培养7天，然后查看斜面上灰绿色菌落（微生物孢子）的生长情况，然后将它们保存在大约4℃ 的条件下一个月左右。
当上述菌落块显示出最佳生产效果时，用斜面种子进行第二次发酵试验。将余下的1/2大小的菌落块悬浮于3毫升的TritonX-100中，将悬浮溶液调匀后，分别取0.1ml接入4支装有MISB-2培养基的斜面试管中，在温度为28℃ 的情况下培养7天。
2.1.2. MIIB-7培养基的组成
MIIB-7
玉米糊精 黄豆粉
磷酸二氢钾 三油酸甘油酯 蒸馏水
在室温条件下，按照上面的顺序，加入上述各成分至最终体积的一半，不断地搅拌，用30% 的KOH将pH调至7.0，然后用蒸馏水补足至规定的体积。用塞好棉花塞并用牛皮纸包好，121℃ 灭
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菌15分钟，然后冷却至室温。它们最好在接下去的一个星期内使用。
2.1.3. MFIB-14培养基的组成及培养条件
MFIB-14
*微量元素溶液
MOPS
玉米糊精 黄豆粉
磷酸二氢钾 醋酸钠
三油酸甘油酯 蒸馏水
按照上述顺序，加入各组分，并不断摇拌。用30%的KOH将pH调至7.0。塞好棉花塞并用牛皮纸包好，121℃ 灭菌15分钟，并冷却至室温。
第二次发酵试验：
将斜面试管中的孢子悬浮在6毫升TritonX-100溶液中，取0.5ml悬浮液接入250ml装有50ml MIIB-7培养基的摇瓶中。在温度25℃ ，转速250RPM的条件下，培养48小时。在下次接种之前，测pH，菌丝含量（3000RPM离心10分钟），检查氨基氮、可溶性磷酸盐。
取上述菌液1.5ml接入250ml装有50ml MFIB-14培养基的摇瓶中，共接6瓶。将摇瓶称重，然后放入摇瓶机培养，温度为25℃ ，2瓶为一组，分别培养4天、5天、6天。培养结束后，根据蒸发损失情况调整重量，测pH和菌丝浓度（4000RPM离心10分钟）。同时测定下述残留物质：氨基氮，用HPLC法测定克拉维酸含量。当分析结果表明两次发酵测试均有较好的生产能力时，将菌种冷冻干燥保存在液氮中。
2.1.4. 接种体的准备
准备 10L MIIB-7培养基用于菌种的培养，将它们放入2L 的锥形摇瓶中（装量为1L）。锥形摇瓶配件包括硅胶塞，软管和接种针（供后面接种使用）。
接种方法如下：
向斜面孢子内加入玻璃球和6ml的TritonX-100溶液并充分振荡，制备孢子悬浮液。 用上述孢子悬浮液接种，并按照下述条件进行培养：温度28℃，相对湿度40%，转速250RPM。培养大约48小时。 此时菌丝体就可以用于初级发酵。然而，为避免接种的摇瓶过多增加染菌的可能性，可将有较高生产能力的接种物摇瓶（无菌，配有硅胶塞，软管和接种针）先在层流柜内合并，再接种。
2.1.5. 菌种的生长或预发酵
准备3.6m3 IBG-2-1培养基放入指定的预发酵培养基配置容器内，培养基的组成如下：
IBG-2-1
Grs/L
黄豆粉 玉米淀粉 三油酸甘油酯 消沫剂 磷酸钠 脱盐水 20.0 20.0 1.0 1.0 0.4 适量
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将pH调至8.5，加入工艺用水到一个适当的体积。将上述培养基转移到预发酵罐中进行灭菌。灭菌条件是121℃ ，35分钟，并需要搅拌。培养基经灭菌以后，冷却至28℃。
按照之前叙述的方法，准备10 L的接种物进行接种，将摇瓶中的菌丝体用蠕动泵逐一输送至接种装置。接种以后，预发酵的的温度28℃，顶部压力为1atm, 通气量为1.8 m3/ min（0.5v/v/min）。搅拌桨外周的速度在2 m/s左右。培养周期应稳定在36-40 小时之间。
当预发酵液的生长情况达到向发酵罐转移的条件，在无菌的条件下完成将预发酵罐中的预发酵液向发酵罐的转移。
2.1.6. 发酵罐
在适当的培养基配置容器内配置36m3 IBF-2-1培养基，培养基的组成如下：
IBF-2-1
Grs/L
黄豆粉 玉米淀粉 三油酸甘油酯 消沫剂 硫酸镁 氯化铁 氯化锌 氯化铜 氯化锰 氯化钙 饮用水
40 19 1 1 0.2 0.028 0.005 0.005 0.005 0.1 适量
按顺序加入上述各组分至培养基配置容器中，并不断搅拌。此时将pH调至5.5 。加入适量的工艺用水。
培养基配置完以后，马上转移至发酵罐进行灭菌。灭菌条件是121℃ ，45分钟。然后，将发酵培养基冷却至25℃。在接种前，用氨水将pH调至7.0；可溶性磷酸盐的水平调至500 mg /L。然后，在无菌空气压力的作用下，预发酵液被转移至发酵罐内，发酵周期开始。发酵应在25℃ ，0.5atm压力下，通气量为36 m3/min，保证一定的搅拌速度，但涡轮的周边转速不应超过4.2m/s，同时保证溶氧不低于20%。发酵过程中，补加氨水将pH控制在6.8，并补加磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）溶液，甘油和三油酸甘油酯。
发酵过程中要进行的分析项目：
pH：发酵开始时，以后每8小时一次。 菌丝含量：发酵开始时，以后每8小时一次 粘度：
可溶性磷酸盐：发酵开始时，以后每8小时一次，直至40小时后，每24小时一次。 氨基氮：发酵开始时，以后每24小时一次。
为了检查生产水平，从约36小时开始，每24小时，测定一次发酵液中克拉维酸的含量，若需要，可增加测定次数。为了检查发酵液是否染菌，应进行如下无菌检查：灭菌以后，接种以后，每隔24小时。
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2.2. 分离提取
2.2.1. 用转鼓真空过滤机过滤发酵液
用乙酸将收集的发酵液的pH调至5左右。然后加入助滤剂，通过转鼓真空式过滤器过滤。收集滤液。
2.2.2. 吸附与洗脱 2.2.2.1. 树脂吸附
用阴离子树脂SA 11A对滤液进行吸附，树脂填充在两根树脂柱内，总体积为4400L，每根树脂柱的体积分别为2200L。
塔内树脂再生后的活化形式为醋酸盐，从柱的上方用水洗脱，水的用量为2v/v，流速为1v/v，洗脱至洗脱液的pH在4-5之间。
将发酵液滤液以每小时3 v/v的流速从上往下注入树脂柱，此时，克拉维酸代替了树脂中的醋酸离子, 吸附在树脂上。吸附时间约为5小时。
树脂被发酵液滤液饱和后，从上至下用水冲洗树脂塔，水的用量为1v/v，流速为每小时2 v/v。
2.2.2.2. 树脂塔的洗脱
当发酵液滤液的吸附完成后，用1M 的NaCl溶液，以每小时0.5v/v的流速，从上至下洗脱克拉维酸，此时，Cl离子取代了树脂中的克拉维酸，克拉维酸进入洗脱液。洗脱时间大约需要10小时。
2.2.2.3. 树脂再生
树脂塔内树脂的再生和准备如下： ? 水洗
? 4% NaOH 溶液洗涤 ? 水洗
? 1M 的醋酸溶液洗涤 ? 1M 醋酸浸泡
2.2.3. 提取
2.2.3.1. 第一次萃取
在酸性条件下，将克拉维酸活性物质从水相转移至非水相(MIBK, 4-甲基-2-戊酮)。
在温度0-5℃的情况下，用硫酸将pH调至2.0左右。酸化的洗脱液和溶媒的混合物进入第一萃取器，进行混合和萃取，同时进行相分离。含有全部克拉维酸活性成分的有机相进入下一步工艺。
抽提后的洗脱液中含有少量的MIBK，送入溶媒回收系统。