翻译
对酿酒酵母的生物杀灭剂聚六亚甲基双胍抗性：细胞壁完整性和目的新兴通路参与作用 作者：卡罗莱纳州，罗德里戈 德卢塞纳和马科斯阿德斯约利（氏）
概括：
背景：聚六亚甲基双胍（PHMB）是一种防腐剂的聚合物，主要用于清洗医院和游泳池和打击Acantamoeba感染。最近它的杀菌剂的活性自己通过对酵母菌污染工业乙醇过程的杀伤作用，并对酿酒酵母PE-2菌株，其中一个主要的发酵酵母，在巴西。这指向需要知道在这种化合物的细胞抵抗背后的分子机制。在这项研究中，我们研究的因素参与PHMB细胞相互作用和机制，应对这种相互作用所造成的损害。要做到这一点，两种研究策略：通过RT-qPCR突变株的分析某些基因的表达。
结果：细胞壁完整性（CWI）基因在酿酒酵母菌株JP-1 PHMB抗性诱导，尽管他们在PHMB敏感酵母PE2不善表达应变。这表明PHMB损伤对酵母细胞壁多糖结构。它也被观察到的敏感的酵母缺失株，SLG1，ROM2，MKK2，SLT2，KNR4证实，SWI4、Swi4，表明蛋白激酶C（PKC）的监管机构参与的反应和抗聚。该hog1突变体灵敏度也观察到。此外，该细胞毒性试验和基因表达分析表明，作用在细胞抵抗YAP1和CTT1基因PHMB是氧化应激反应的关系。因此，我们建议，Yap1p可以发挥作用的细胞壁维护控制CWI基因的表达。 结论：酵母细胞的PHMB处理激活Pkc1/Slt2（CWI）通路。此外，建议可以在CWI HOG1 YAP1基因起调控作用。
背景：以前的工作已经表明，聚壁挂尼德（PHMB）是选择性杀伤，作为乙醇发酵过程中酵母的特殊污染物有效，ATT被支付的德克bruxellensis。PHMB已作为医药行业的防腐剂和消毒剂，其目前的应用包括：浸渍织物能抑制微生物的生长，水处理，范围很广，如隐形眼镜固体表面消毒，漱口，孵化鸡蛋的沙门氏菌防止污染的处理、治疗抗真菌和棘阿米巴。它的商业制剂组成的混合物聚合双胍类块与分子结构[ CH2）6。NH。C（= NH）。NH。C（= NH）。NH ] n，n的变化从2到40（平均11），分子量从400到8000 。
分子的异质性是由或胺的存在进一步增加，或cyanoguani用餐或在每个链的终端位置任意组合的胍基团。然而SS的胍基阳离子性质使正电荷在生理pH值低 [分子]。作为一个结果，是聚阴离子高吸附性表面如细菌的细胞壁，其杀菌机制可能包括细胞膜损伤。在较低的浓度下，它已经表明，聚马的抑菌作用Y是由于强大的协同作用（波利亚离子）核酸。这表明PHMB应与脊椎moeba细胞膜磷脂的相互作用，从而导致细胞通透性的变化，这是由大肠杆菌工作进一步支持。对酵母属酵母等酵母质膜外层增强由卵磷脂、麦角甾醇和鞘脂类。由于对聚阳离子的性质，其毒性作用可能是通过其链接到阴性磷脂在酵母细胞表面介导。在聚磷脂的存在，通常与生物膜的均匀分布，转化为一个马赛克个别磷脂域产生F1液体和液体在细胞膜晶区。通过全基因组转录谱、艾伦等人表明，大肠杆菌的抑菌浓度的PHMB的ALTE环的许多基因参与各级细胞超微结构的表达，即外膜，膜，膜内和胞质结构域，但不是脂多糖L艾尔。也有一个改变的基因的表达与应力，如耐酸性，抗碱，渗透性休克和细胞包络扰动。
以及在D. bruxellensis的杀菌活性，Pichia galeiformes和热带假丝酵母，酵母物种隔离PHMB作为污染物通过乙醇发酵，而这也差异影响酿酒酵母工业街下雨了，例如PE-2应变比JP1 [ 1 ]的影响。这个结果可能对控制事件的酵母污染的工业发酵PHMB使用限制。因此，进一步的步骤，发展聚工业制剂，必须依靠确定对酵母细胞的生物活性和目标识别和鉴定PHMB，酵母的机制，应对该杀菌剂造成的损害。
在这项研究中，我们试图了解PHMB细胞相互作用的上述方面，采用两种策略：1）检测PHMB对酵母基因表达的生物效应参与细胞壁完整性机制（CWI）和2）的测试，在参与
CWI和氧化应激反应的基因突变的酵母菌株。结果表明，聚可以通过破坏酵母细胞壁，从而诱导细胞壁的完整性途径应答。此外，一个帐户被赋予的潜力的Yap1p在CWI基因表达的调节作用。
结果与讨论
PHMB处理诱导酵母细胞壁的完整基因（CWI）传感机理
我们以前的研究结果表明，对酵母细胞的杀伤作用部分是由PHMB海藻糖[ 1 ]减轻，这被称为是一种细胞膜保护剂。此外，以前的G全球基因表达分析表明，暴露的大肠杆菌细胞PHMB诱导参与细胞壁维护基因的表达。这促使我们寻找酵母CWI基因基因组（额外的文件1）。此外，最近的研究表明，一些参与海藻糖代谢的基因调控应激反应元件（应力）在其启动子区；在VI对抗这个我们有一些酵母基因包含在我们的分析中，他们的启动压力。从列表中选择的基因，我们进行了定量PCR分析后细胞接触PHMB和结果表明CHS1，fks1 GAS1，Hsp150，KRE6，MSN2，Msn4，pKH1和ylr194c基因在PHMB抗性JPI应变上调，而在PHMB敏感PE-2应变保持不变（图）。此外，CRZ1和Rlm1 GENES是诱导JP1和压抑的PE-2，而cin5和mnn9没有改变JP1，但被压抑在PE-2。该片段的表达在工业菌株中的基因保持不变。
CHS1、GAS1 fks1 hsp150，KRE6产品pKH1和ylr194c基因可能位于细胞膜或细胞壁，且大多涉及的维护和重构响应环境变化的细胞信封。膜位于几丁质合成酶1，编码由CHS1，在间隔的几丁质的细胞分裂在转行为。GAS1基因产物是GPI锚定蛋白定位于细胞膜，通过拉伸盖B-1,3-葡聚糖的细胞壁的重塑过程中的作用。它的表达依赖于某人F的转录因子，包括Swi4p Swi6p蛋白。fks1基因编码的1,3-b-d-glucan合成酶的催化亚单位。这种复杂的调节控制托利亚基Rho1p，而这又是由营养传感TOR途径调节蛋白激酶C的Pkc1p活性激活，细胞壁的完整性的一个关键组成部分（CWI）机制。的hsp150p蛋白位于细胞壁和分泌到培养基中的反应热或渗透压休克。其基因表达上调在Calcofluor white和酶的酶，热SH玉珠氮限制处理以及通过降低细胞壁的B-1,3-葡聚糖水平。该基因编码一个TOL pKH1磷酸依赖的蛋白激酶，其功能重叠Pkh2p，并参与维持细胞壁。这种蛋白质的磷酸化和激活Pkc1p。ylr194c的ORF编码一个假定的GPI连接蛋白，其表达是诱导BY细胞壁应力或由fks1基因突变。的同源基因编码一个b-1,6-mannosyltransferase在合成在从UDP-甘露糖转移寡糖参与对细胞壁的β-葡聚糖桥。此外，该KRE6基因编码一个假定的合成酶，在这个基因的突变b-1,6-glucan盖和合成行为导致50%红在细胞壁在b-1,6-glucan合成生产。的kre6p蛋白被证明是磷酸化和基因的Pkc1p部件相互作用介导的MAP激酶途径为了规范b-1,6-glucan合成。结果发现，在基因表达中的KRE6抵消PKC1突变细胞壁组织缺损。因此，这个基因可以要解释这两个工业菌株耐PHMB差异的关键，因为它是在聚来的高表达耐药株。
图1中涉及细胞壁完整性 机制和一般应激反应的酵 母基因的相对表达。相对量 表示在T中的研究基因的 表达他PHMB处理的细胞（0.01%）在未经处理的细胞的两个工业菌株JP1（红柱）和PE-2（蓝色柱）。 Crz1p是钙依赖性锌指型转录因子结合到响应的形成和钙的fks1和CHS1基因的启动子，分别为这两个基因被发现是有限的表示，在G1峰，当各向同性的细胞壁的合成允许女儿细胞膨胀和我们的结果（图1）证实的共表达模式。较低的表达在PE-2的CRZ1基因N水平可以解释这株CHS1和fks1感应的不足，并结合KRE6低表达，可以产生之前说到的敏感现象PHMB PE-2应变式。此外，这些结果表明，对JP1应变耐受可能在它被损坏的B是由于一个更有效的细胞膜修复Y PHMB。这可能表明PHMB损害葡聚糖结构对酵母细胞壁。
抗PHMB取决于功能的PKC和养猪的机制
检测细胞壁损伤假说，对酵母菌株在一系列的CWI基因的缺失抗PHMB，包括基因在猪和PKC途径。的细胞毒性试验的结果表明，删除的WSC1、SLT2，ROM2，Swi4，Swi6和KNR4基因受损的细胞存活的机会接触PHMB，而缺失HOG1和MKK2基因只影响细胞生存在较高浓度的聚论（图2）。测试的其余的突变体没有表现出改变这种化合物的敏感性（数据未显示）。SLG1 / WSC1基因编码的一个传感器蛋白位于细胞膜E使GDP / GTP响应于细胞壁损伤交换蛋白rom2p。据观察，这种蛋白的缺失会激活Slt2p/Mpk1p热休克激酶。过敏性的SLG1 / WSC1突变体PHMB（图2），连同其他酵母突变体的亲本表型传感器，表明slg1p / Wsc1p是造成PHMB损坏的主要传感器。在PKC的级联，可以观察到ROM2突变是PHMB非常敏感（图2）。GTP / GDP交换因子rom2p激活Ras蛋白激酶PKC Rho1p触发级联激活Pkc1p，这反过来又激活该bck1p 。bck1p，称为地图kinase kinase kinase（MAPKKK），磷酸化mkk2p（MAPKK）在细胞壁的破坏，从而进一步磷酸化，尖吻鲈/ Slt2p（MAPK）。父母phenotyPE的BCK1突变的敏感性和中介遗传筛选突变体PHMB（图2）可以通过互补的同源bck2p和mkk1p分别的解释。
此外，该种超敏MPK1 /突变（图2）显示，在聚抗性基因的重要片段。Slt2p主要居住在非胁迫条件下核，但迅速搬迁到响应的细胞壁应力细胞质。一旦被激活，磷酸化和激活Rlm1p Slt2p转录因子，以及swi4p。正如一个博韦，Swi4p Swi6p形式模拟调控转录因子基因的儿童，如GAS1 FKS1和smi1 / KNR4 。该smi1 / KNR4基因突变的酵母细胞的敏感性增加LS PHMB（图2）。建议smi1p / Knr4p应与细胞壁合成有关的协调细胞周期进展，这种蛋白被证明为生存力是必不可少的在功能性Pkc1/Slt2途径没有细胞Y。Knr4p与Slt2p之间的物理相互作用也作了介绍，提出了这样的相互作用调节Slt2p依赖兔子Rlm1和SBF激活转录因子。激活Rlm1p诱导CHS1，fks1表达KRE6和hsp150 ，相同的基因上调JP1应变对PHMB T治疗（图1）。
最后，Hog1突变显示中间的敏感性PHMB（图2）。建议在震动，hog1p激活Rlm1p反过来调节T随后的表达他SLT2基因。因此，生猪和PKC MAPK通路之间的串扰应建立细胞壁的扰动。本研究的结果表明，hog1p可以作为对细胞壁的破坏引起的PHMB的传感机理的一种放大器，最近已经描述的其他细胞壁损伤。此外，双突变体分析表明，有一个hog1p Yap1p之间协同作用，在抗砷胁迫，这表明遗传相互依赖的基因在应激反应的存在。重新分的研究表明，hog1p参与细胞壁通过调节exg1基因表达的重构，它编码影响β-葡聚糖的葡聚糖酶水平。这一假说的支持的想法，PKC和生猪通路的调节吃了细胞壁的的维护。根据这些证据，我们建议PHMB可影响细胞壁的结构，b-glu-can通过PKC途径感知连同hog1p。
图2细胞毒性测定酵母CWI突变 体不同剂量的聚。活细胞的百分 比后处理是指在处理样本数过数 与非治疗给定应变的试样。
YAP1基因也参与细胞的抗聚，但不是通过氧化应激反应
在JP1株MSN2和Msn4基因在接触PHMB诱导后（图1），我们进一步筛选缺失株的基因编码的蛋白质参与了收集复杂的一般应力响应机制。其中，YAP1突变体表现出高度的敏感性PHMB（图3A，B）。这是暗示诱导的氧化通过聚到细胞膜伤害我。的Yap1p介导的调控通路，控制氧化应激的适应性反应是氧化还原的感觉机制，检测变化的活性细胞内氧化还原平衡分子引起的活性氧（ROS）和氧化硫醇，如谷胱甘肽、含蛋白质thiorredoxin和SH。包括非蛋白巯基，（NP-SH），主要表现为谷胱甘肽，和蛋白结合（pb-sh），具有丰富的细胞可以通过ROS氧化。然而，我们并没有观察到只有一个小的变化，动员OF细胞内巯基当BY4741或YAP1菌株提交PHMB 72小时，因为它是H2O2的参考治疗后观察（图4B）。此外，没有增加的过氧化作用膜phospholi PIDS观察（数据未显示）。此外，在氧化应激基因的缺失没有其他菌株敏感的PHMB，除了CTT1突变体（图3b，4a）。该CTT1基因编码参与过氧化氢为氧和水的分解胞内过氧化氢酶，它是由氧化应激转录因子通过调控Yap1p和Skn7p一般应激反应的转录复合物的MSN2 / 4p 。winderickx等人。发现，CTT1氧化应激诱导的表达需要Yap1p即使这个基因不包括长江口在其启动子序列，尽管它包含了强调主题。yap1p参与调节的抗氧化基因和多种耐药基因[自然]，这个转录因子Regulates基因不在其启动子区域的有口。yap1p调节组件的应力激活机械的表达起到了重要作用，并作为一个结果，应力解悬而未决的基因表达，尽管不一定是直接的目的。这表明，YAP1和CTT1基因可能参与抗聚的一种方式，不与氧化应激反应途径。这里有一些迹象表明，对细胞的生存PKC通路上元素的部分cipation时受到氧化剂如尿素和过氧化氢。这是K得知乙醇诱导的各种胁迫应答基因的表达，如CTT1通过MSN2 / 4转录复合物结合到启动子。这种复合物被何G1P磷酸化，导致从细胞质Msn2p和msn4p迁移到细胞核，这样他们可以触发诱导靶基因的。这表明有一个连接CWI通路间（pkc-hog）和氧化应激反应在酿酒酵母中，它可以作为一个桥梁ctt1p。最近，刘等发现SOD1基因在酵母中的细胞壁损伤剂的耐受性，它支持这些途径之间的连接。结果表明，Yap1p似乎是要激活编码细胞壁蛋白SRP1基因。YAP1突变体的报道是敏感的刚果红，我们也观察到（数据没有显示）。总之，证据指向的Yap1p在CWI机制参与。
图3细胞毒性检测PHMB酵母菌株与氧化应激反应基因的缺失。（一）现场试验 父母BY4741和YAP1突变体氧化剂H2O2和聚。（B）的剂量反应细胞的存活在 CTT1聚法、TSA1和YAP1基因突变株。
图4细胞毒性检测PHMB酵母菌株与氧化应激反应基因的缺失。（一）在没有聚在YPD板存在斑点试验法。（b）测定的关系我在可溶性蛋白巯基（PB）和非蛋白（NP）分子在酵母细胞和BY4741父母YAP1突变株的细胞提取物的0.005%聚、5 mm H2O的存在2。