牛奶中部分成分的分析
1.实验目的
1.1设计合适的实验方法来分析牛奶中蛋白质与钙的含量 1.2学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白 1.3熟悉可见光分光光度计的操作。
1.4加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼。 1.5掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。
1.6掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法。
1.7通过与牛奶包装上注明的含量比较，学会对自己实验分析结果进行客观评价。
2. 实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g·L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe、Al等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。
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3. 实验步骤
1
3.1 主要原料和仪器 3.1.1材料
新鲜牛奶、加钙牛奶
3.1.2试剂
95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuSO4·5H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、钙指示剂
3.1.2.1 0.5 mol·L-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液
先配A液与B液。A液：0.5mol/L醋酸钠溶液。B液：0.5mol/L醋酸溶液。 A液：4.1g醋酸钠，加水至100ml定容；B液：2.85ml醋酸，加水至100ml定容 取A液50mL，B液50mL混合即得pH4.7的HAc-NaAc缓冲液100mL。
3.1.2.2乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）95%乙醇和乙醚各25ml 3.1.2.3 NaOH（6mol·L-1）：称取24g氢氧化钠溶于100mL水中。
3.1.2.4双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0g，酒石酸钾9.0 g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加
6 mol·LNaOH l00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。
-1
3.1.2.5 0.9％NaCl（即生理盐水） 1.8g NaCl 200ml水
3.1.2.6蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解
后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。
3.1.2.7待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋
白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol·L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容），量取30.00ml纯牛奶，倒入100ml容量瓶中，定容。
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3.1.2.8 EDTA(0.01mol·L-1)：称取2.0g EDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于聚
乙烯塑料瓶中。
3.1.2.9 CaCO3标准溶液(0.01 mol·L-1)：准确称取基准物质CaCO3 0.1g左右，先以少量水润湿，再
逐滴小心加入6 mol·LHCl，至CaCO3完全溶解，定量转入100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。
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3.1.2.10 NaOH（5 mol·L-1） 20g NaOH 100ml 水
2
3.1.2.11 HCl（6 mol·L-1） 50ml 浓盐酸（12mol/L）50ml水 3.1.2.12 三乙醇胺(200g·L-1) 20g 三乙醇胺 100ml水
3.1.2.13铬蓝黑R(5 g·L-1)乙醇溶液 0.5g 铬蓝黑R 100ml乙醇 3.1.2.14注意：
本实验中需要准确称量的物质质量：0.2 mol·L-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、蛋白质标准液(10mg·mL-1)、锌标准溶液（1.00μg·mL-1）、双硫腙四氯化碳溶液；
要准确量取的溶液体积：牛奶的用量、EDTA(0.01mol·L-1)、蛋白质标准液、待测蛋白样品、0.9%NaCl、双缩脲试剂、铁标准溶液、盐酸羟胺溶液、邻二氮菲溶液、醋酸钠溶液、铁标准溶液、四氯化碳、缓冲溶液、硫代硫酸钠溶液。
3.1.3仪器
试管、移液管（1mL、2mL、5mL 10mL、20mL）、l0mL容量瓶、烧杯、表面皿、250mL锥形瓶、1000mL棕色试剂瓶、10mL具塞比色管×8和比色管架、试管、试管架、50mL离心管×2、容量瓶（100mL、250mL若干）、烧杯（150mL、250mL若干）
分析天平（内置2个称量瓶）、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、酸度计、精密pH试纸（可测pH4.7）、电炉、温度计、水浴箱。
3.2牛奶中酪蛋白的提取 3.2.1酪蛋白的粗提
50mL鲜牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液（40mL左右），用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。（pH调不好，出不来沉淀）
将上述悬浮液冷却至室温。（7楼734）离心15分钟（3000 r·min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
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3.2.2酪蛋白的纯化
用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min），弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干（抽滤困难）。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。
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3.2.3准确称重，计算含量和得率
3
含量：酪蛋白g/(100 mL)牛乳
得率?提取得到的含量?100%
真实含量3.3酪蛋白含量的测定
3.3.1标准曲线的绘制与样品的测定
取试管8支，按下表操作。
表1 酪蛋白含量的测定
蛋白质标准液
(mL) 待测蛋白样品
(mL) 0.9%NaCl(mL) 双缩脲试剂(mL) 吸光度A 蛋白质浓度（g/100mL）
1 2 3 4 5 6 测定管1 测定管2 － 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 － －
－ 2.00 8.00
－ 1.60 8.00
－ 1.20 8.00
－ 0.80 8.00
－ 0.40 8.00
－ - 8.00
2.00 － 8.00
2.00 － 8.00
各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。540nm比色，以空白管(1号管)调零点，读取各管吸光度值。
3.3.2计算
在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g·L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。
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3.4钙含量的测定
4
3.4.1 EDTA溶液浓度的标定
准确移取20.00mL CaCO3标准溶液3份分别于250mL锥形瓶中，加入2mL NaOH溶液，铬蓝黑R指示剂3~4滴（视指示剂的有效浓度而定），用EDTA溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去EDTA毫升数和CaCO3标准溶液的浓度，计算EDTA溶液的浓度。
表1 EDTA浓度的标定
实验序号 Ca标液体积/mL 初始读数 EDTA/mL 终点读数 消耗体积 EDTA浓度/mol·L EDTA平均浓度/mol·L
-1-12+ 1 2 3 3.4.2钙制剂钙含量的测定
准确移取50.00ml（20.00ml，仪器里面最大是20.00ml移液管）的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·LNaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R3~4滴，用0.01mol·LEDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑R，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（mg/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。（消耗约25 ml EDTA）
表2 钙含量的测定
样品(ml) 20.00 纯牛奶 20.00 20.00 20.00 高钙奶 20.00 20.00 -1
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