EPSP(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷
酸,5-enolpyruvylshikimate -3-phosphate)合成酶基因
（aroA，1.3kb） 克隆、定点突变
1 PCR引物
所有引物由申能博彩公司负责合成： （1） aroA基因的PCR引物 Primer1（上链）：5’- ATCTCTAGAATGGAATCCCTGACG-3’ Primer2（下链）：5’- GTTGAGCTCTCAGGCTGCTTG-3’ （2） aroA突变G-A引物 Primer3（上链）：5’- TTGTTCCTCGGTAACGCCGCAACGGCAACGCGTCC-3’ Primer4（下链）：5’- CAGCGGACGCGTTGCCGTTGCGGCGTTACCGAGGA-3’
2.培养基
LB培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用NaOH调pH至
7.5，灭菌后待用。加1.5%琼脂配成固体培养基。
3 实验仪器
SIGMA冷冻离心机，高压灭菌锅，ZF紫外透射分析仪，凝胶电泳成像仪，
电泳仪，水平板电泳槽及梳子，PCR仪，移液枪及枪头和各种eppebdorf。
实验步骤与实验方法
2.1 细菌基因组DNA的小量制备
材料
TE缓冲液
10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）
20mg/ml蛋白酶K 5mol/L NaCl溶液 CTAB/ NaCl溶液 24：1氯仿/异戊醇
25：24：1酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70%乙醇 步骤 1．培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物12000rpm离心15min。 2．沉淀物加入567μl 的TE缓冲液，用吸管反复捶打使之重悬。加入30μl 10%的SDS和3μl 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。
3．加入100μl 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。
4．加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，离心4min。将上清液转入一个新管中。 5．加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心5min，将上清转入一只新管中。 6．加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ，离心去上清，用 70%乙醇中洗涤。
7．离心5min，弃上清，自然干燥，重溶于30μl 的TE缓冲液。
2.2 PCR反应
2.2.1 aroA 基因的PCR扩增：
（1）在0.5ml Eppendorf管中加入： ddH2O 18.2μl 10×PCR Buffer 3μl MgCl2（25mM） 3μl dNTP （10 mM） 0.8μl primer 1(10pmol/μl) 1μl primer 2 (10pmol/μl) 1μl 模板基因组 2μl Taq酶（5U/μl） 1μl
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 30μl 石蜡油 30μl 反应程序为：94℃ 4min 94℃ 30s
56.1℃ 90s 72℃ 120s 72℃ 10min
2
34个循环
PCR产物经电泳鉴定并kit纯化。
2.2.1.1 0.8%琼脂糖凝胶的制备
1．称取0.8g琼脂糖,置于小三角瓶中,加入100ml 1 x TAE稀释缓冲液，微波炉加热至琼脂糖完全熔化,取出三角瓶，轻轻摇匀；
2．用胶带将凝胶槽缺口封住，置工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内； 3．小心地将胶液倒入凝胶槽内，使之缓慢地展开直至形成约3mm厚的胶层，静置20分钟；
4．待琼脂糖凝胶液凝固后，双手均匀用力轻轻拔出梳子；
5．取下封边胶带，将凝胶连同槽放入电泳槽平台，让TAE稀释缓冲液浸没过凝胶面2mm。
2.2.1.2 加样
用移液枪将样品液与上样缓冲液按6混合后，分别加入胶板的加样孔内。加样。
2.2.1.3 电泳
样品端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。观察和拍照。小心地取出凝胶槽，将凝胶在缸中染色10mins，然后在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光。肉眼可观察到清晰的条带。
2.2.1.4 目的片段的电泳回收
DNA kit回收法：
（1）切胶回收后，将胶切碎或在离心管内用1ml枪头捣碎，称重。 （2）加入1.5倍体积的溶液Ⅰ，vortex或颠倒混匀。
（3）50℃ 水浴加热约10分钟至胶全溶，期间，需vortex颠倒混匀3-4次，以
加速凝胶溶解。
（4）加入到DNA纯化柱内， 12,000rpm离心15秒，倒弃收集管内的液体。 （5）在DNA纯化柱内加入750μl溶液Ⅱ，12,000rpm离心15秒，洗去杂质。
3
（6）12,000rpm再离心1分钟，除去残留液体。
（7）将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入30μl溶液Ⅲ至管内柱面上，放
置1分钟。 （8）12,000rpm离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。
2.2.2 PCR突变aroA基因中287位点：
（1）在0.5ml Eppendorf管中加入：
ddH2O 37μl 10×PCR Buffer 5μl MgCl2（25mM） 3μl dNTP （10 mM） 1μl primer 1(10pmol/μl) 1μl primer4 (10pmol/μl) 1μl Template (2. 2．1．4 目的片段) 1μl Taq酶（3U/μl） 1μl －－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 50μl 石蜡油 50μl 反应程序为：94℃ 3min 94℃ 1min
55.9℃ 40s 72℃ 40s 72℃ 10min 4℃ 2h
34个循环
（2）PCR产物经电泳鉴定并kit纯化。
（3） 在0.5ml Eppendorf管中加入：
ddH2O 37μl 10×PCR Buffer 5μl MgCl2（25mM） 3μl dNTP （10 mM） 1μl primer 2(10pmol/μl) 1μl primer 3 (10pmol/μl) 1μl Template(2. 2．1．4 目的片段) 1μl Taq酶（5U/μl） 1μl －－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 50μl 石蜡油 50μl 反应程序为：94℃ 5min
4
94℃ 1min
55.9℃ 40s 72℃ 90s 72℃ 10min 4℃ ∞ 34个循环
（4）PCR产物经电泳鉴定并kit纯化。
（5）在0.5ml Eppendorf管中加入：
ddH2O 37.7μl 10×PCR Buffer 5μl MgCl2（25mM） 2.5μl dNTP （10 mM） 0.8μl primer 1(10pmol/μl) 0.8μl primer 3 (10pmol/μl) 0.8μl Template1（步骤2中纯化回收的NDA片段） 0.8μl Template2（步骤2中纯化回收的NDA片段） 0.8μl Taq酶（5U/μl） 0.8μl
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 50μl 石蜡油 50μl 反应程序为：94℃ 5min 94℃ 1min
55.9℃ 40s 72℃ 90s 72℃ 10min 4℃ ∞
34个循环
（6）电泳鉴定并纯化，获得经修饰去除了287位点的aroA基因。
2.2.3 目的片段aroA与载体pUC119连接
在Eppendorf管里分别加入：
ddH2O 1μl 10×Buffer 1μl pUC119（XbaⅠ/SacⅠ） 1μl aroA（XbaⅠ/SacⅠ） 6μl T4ligase 1μl
------------------------------------------------------- 10μl 16℃ 连接3h
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