湖北师范学院?分子生物学综合试验论文
论文题目 作者姓名 专业名称 准考证号 指导教师
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
樊恒达 生物技术 2008114020308 王友如
中国·黄石
I
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
樊恒达
（湖北师范学院生命科学学院0803班学号：2008114020308，湖北 黄石）
摘要
目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达。方法：从E.coli DH5ɑ中用碱法提取质粒的方法提取质粒pET-28a-GFP。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的质粒进行电泳，用以确定已经提取的质粒中含有GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。最后用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。结论：本实验对学生掌握
最基本的分子生物学试验技术奠定了基础。
关键词：绿色荧光蛋白 基因克隆 重组表达 转化
II
Green Fluorescent Protein (GFP) Gene Cloning and Expression
Fan Hengda
(class 3 grade 8, college of biology science ,Hubei Normal university, Huang Shi) :
Abstract
Objective: searching for the phenomenon of green fluorescent protein gene’s
cloning and restructuring expression in the E.coli .Method: drawing plasmid pET-28a-GFP from E.coli DH5ɑ by using the method of Alkali Distillation .Then the selected production can be electrophored by using the AGE ,in order to make sure drawing successfully plasmid from E.coli. The selected plasmid is cutting by the extinction enzymes BamHI and NotI and the sliced plasmid can be electrophored by using the AGE in order to ensure the selected plasmid containing GFP gene .Converting the plasmid having gene of GFP into the feeling states E.c oli BL - 21 cells and cultivating it largely through the LB medium .Finally the IPTG can guide the expression of GFP gene and we can see light green clonies .Conclusion:This experiment sets up foundation for students to master the basical experimental technology of molecular biology .
III
目 录
引言 .................................................................................................................................................................. 3 材料与方法....................................................................................................................................................... 3
1材 料 .................................................................................................................................................... 3
1.1材料 ............................................................................................................................................ 3 1.2仪器 ............................................................................................................................................ 3
1.3试剂 ............................................................................................................................................ 3 2方 法 .................................................................................................................................................... 3
2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建 .......................................................................................... 3 2.2碱法提取质粒 ............................................................................................................................ 4 2.3质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 .................................................................................................... 4 2.5.E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化 ................................................................................ 4 2.6 扩大培养 ................................................................................................................................... 4 2.7 GFP蛋白的诱导表达 ................................................................................................................ 5
结 果............................................................................................................................................................. 5
1实验现象 ................................................................................................................................................ 5
1.1 碱法提取质粒 ........................................................................................................................... 5 1.2碱法提取质粒电泳 .................................................................................................................... 5 1.3酶切质粒电泳 ............................................................................................................................ 5 1.4重组质粒的转化及阴阳性对照 ................................................................................................ 6 1.5 GFP蛋白的诱导表达结果 ........................................................................................................ 6 1.6 紫外灯下看到的绿色荧光蛋白 ............................................................................................... 7 ........................................................................................................................................................... 7
讨 论 .............................................................................................................................................................. 7 参考文献........................................................................................................................................................... 8
2
引言：2008年10 月 8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）
【1】的发现者和推广者。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。近年来在生物化学和细胞生物学中成为应用最为广泛的标记性蛋白之一。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代
分子。
材料与方法
1材 料
1.1材料：大肠杆菌DH5ɑ购自微生物实验室，质粒pET-28a-GFP由本实验室保存，限制性内切酶BamHI和NotI购自TaKaRa公司。
1.2仪器：GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）； 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）； 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）； 电子天平TE412-L，TE2101-L； BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂) ；SW-CJ-1FD双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）； 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱；高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）；蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪、酒精灯、培养皿、移液枪、 枪头 、接种环 、酒精棉球 、离心管、高速冷冻离心机、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、恒温水浴锅等。 1.3试剂：溶液Ⅰ（50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0）10mM EDTA），溶液Ⅱ（0.2N NaOH，
1% SDS），溶液Ⅲ（5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml）由上海生工公司提供 ；BL21，琼脂糖，LB培养基，冰块等其他材料均为本实验室保存。
2 方 法
2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建（该过程由指导老师完成）
DH-5ɑ(Pds-RFP-N1) DH-5ɑ(pET-28ɑ) 质粒 提取 质粒 提取 质粒Pds-RFP-N1 质粒 pET-28ɑ 酶切 回收 酶切 回收 插入片段 载体片段 连 接 重组质粒（pET-28ɑ-RFP） 转 化 DH-5ɑ（pET-28ɑ-RFP）
3