果蔬采后生理学结课论文
拮抗酵母菌对苹果采后病害防治的研究进展
学生：符利华(2007112870) 指导老师：魏长庆
摘 要: 果蔬采后病害在世界范围内一直造成较重大的经济损失,使用化学杀菌剂是控制其发生
的主要手段。但化学杀菌剂的大规模使用不仅会导致病原菌产生抗药性,而且造成食品中的农药残留问题，因此急需寻找新的方法用于果蔬采后病害防治。近年来,生物防治已逐渐成为一种可替代化学杀菌剂的防治方法,其中拮抗微生物的应用,尤其是来自果蔬表面的拮抗酵母菌对控制采后病害已经取得了巨大作用
关键词：苹果；采后病害；生物防治；拮抗酵母菌;防治机理
Resistance is the virus to pick apples after the disease
prevention and control research
Student：Fu lihua(2007112870) Instructer: Wei Changqing
Abstract: Fruits from the disease in the world has caused a major economic losses, the use of chemical antiseptic is the main means of control. but the chemical fungicides of the large-scale use not only lead to a pathogen , and the cause of the pesticide residue problems of food, so urgently required for the new method is used to adopt disease prevention. In recent years, biological control has gradually become a substitute for chemical fungicides of control methods which is against the application, especially from the fruits of the surface of the population is to gather to control the disease has already made great use. Keywords:apple; Postharvest diseases; biological control; Antagonism yeast ;Control mechanism
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0 前言
果蔬因采后腐烂而造成的严重损失早已经成为全球性的问题。最常用的控制果蔬采后腐烂的方法是化学杀菌剂，但长期使用会引起病原菌的抗药性、影响果蔬食用的安全，且造成环境的污染。近年来,安全、无毒的生物防治已逐渐成为一种可替代化学杀菌剂的防治方法,其中拮抗酵母菌在控制苹果采后病害上，就已取得较好的成就
[1]
。
1 拮抗酵母菌对苹果采后病害防治的实验进展 1.1 苹果采后病害
苹果主要的采后病害有青霉病、灰霉病、炭疽病。
青霉病主要病原菌为扩展青霉，青霉菌是采后病菌，主要通过苹果表皮的裂口进入组织，在运输、贮藏过程中它也可以从罹病苹果向相邻的健康苹果蔓延。
灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的。由此菌引起的腐烂可以从果实的花蒂或茎端开始，或从任何伤口开始。
炭疽病是由炭疽菌引起的一类常见真菌病害。在苹果贮藏期间，能造成大量苹果的腐烂，对苹果产业有很大的影响[2]。 1.2 生物防治
植物的生物防治有防病和防虫两种。本文只讨论苹果病害的生物防治。所谓病害生物防治就是利用微生物之间的拮抗作用，微生物间在氧、水分、营养成分及空间等各方面的竞争作用，微生物与病原菌亲缘关系相近的菌系形成交叉的保护作用，选择对农作物或农产品不造成危害的微生物来抑制病原菌的生长[3]。 1.3 拮抗酵母菌 1.3.1 拮抗酵母菌的来源
拮抗酵母菌可以从很多地方获得，如果实表面、果蔬叶子表面、土壤、植株吐水液中等等。例如在病害预期发生但还没显症的健康苹果表面就可能寻找到期望的酵母拮抗菌[4]。
1.3.2 拮抗酵母菌对苹果采后病害防治的效果
目前已经证明对苹果采后病害具有防治作用的拮抗酵母菌品种有很多，而且有很多品种已经商业化。范青等实验了丝孢酵母的不同处理对“富士”苹果灰霉病和青霉病的抑制效果,结果表明,当接种灰霉菌和青霉菌孢子浓度分别为1×105个/L和5×104个/L时,在25℃,1×108CFU/L的酵母悬浮液完全抑制了这两种病害的发生。梁泉峰等从腐败玉米中分离到一株间型假丝酵母,对苹果青霉病具有显著的防治效果,接种
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致病菌后25℃贮藏7d的苹果,对照组(未接酵母菌)的病斑直径达12mm,而接种酵母菌的果实未见病斑。
1.4 拮抗酵母菌对苹果采后病害防治机理
苹果属于组织柔嫩多汁,并含有糖分的产品，在采摘、运输、贮藏过程中极容易被损伤，为病原微生物的入侵创造条件。拮抗菌、病原菌和寄主三方在外部环境的影响下相互作用,每一种拮抗菌拮抗有效的效果往往是多重机理共同作用的结果。 1.4.1 空间与营养的竞争
营养或空间的竞争是拮抗酵母菌生物防治作用的主要机制。拮抗酵母菌在尽可能短的时间内，与病原菌竞争营养物质和氧气、抢占物理位点和生态位点，在寄主上占优势地位[5]，使得病原菌得不到合适的营养与空间进行孢子的萌发，而起到了抑菌的效果。
1.4.2 诱导寄主抗性
通过诱导寄主抗性来增强苹果的抗病性是一种切实而重要的可行方法，Ippolito等发现类酵母拮抗菌Aureobasidipullulans在苹果上可以显著提高几丁酶、B-l,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的活性。 1.4.3 重寄生作用
重寄生作用是指以吸附生长、缠绕、侵入、消解等形式抑制病原菌[6]。重寄生作用主要是由于拮抗菌与病原菌接触时，拮抗菌分泌B-l,3-葡聚糖酶、几丁质酶等细胞外物质，从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体，达到抑菌效果。 2 三株拮抗酵母菌对苹果采后青霉病的防治效果 2.1 活体条件下3株拮抗酵母菌的生长动态
3株酵母菌在苹果果实伤口处均能迅速繁殖。3株酵母菌3SJ、2SP和3SD在接种后2 h(0 d)的起始酵母菌数目分别为7×105、3×105和5×105cfu/mL,酵母菌3SJ和3SD的数量在培养3 d时达到最高值,较起始数量提高了近10 000倍;酵母菌2SP的数量在培养5 d时达到最高值,较起始数量提高了近3 000倍。之后酵母菌数量逐渐下降,但较缓慢。
2.2 三株拮抗酵母菌对青霉病的防治效果
果实刺伤接种结果表明,含量为1×108cfu/mL的3株拮抗酵母菌对由青霉菌引起的采后腐烂病具有明显的防治效果[7]。与病菌对照相比,酵母菌2SP防治效果最好,为96%;酵母菌3SJ与之防效相当,为92%;而3SD防治效果次之,为80%。
从表1可以看出,与对照(处理F)相比,3株拮抗酵母菌采用处理A(无菌水配置的孢
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子悬浮液)和处理B(用NYDB配制的孢子悬浮液)对苹果果实采后青霉病均有较好的防治效果,处理A的病斑直径小于处理B,防治效果较处理B高;处理C(离心后上清液高温灭菌)和处理D(上清液通过0.2μm的滤膜过滤)对于病斑的扩展没有抑制作用;而处理E(培养液)还会导致病斑增大。
表1 3株拮抗酵母菌的不同处理液对青霉病的防效
Table 1 3 strains of antagonism of different processing of the mildew green 处理
3SJ
防效/% Efficacy
2SP
病斑直径/mm
防效/% Efficacy
3SD
病斑直径/mm
防效/% Efficacy
A B C D E F(CK) 2.3讨论
酵母菌作为果蔬生物防治拮抗菌的最大优点在于,其能于较干燥的果蔬表面生存,并能迅速利用营养进行繁殖。本实验表明,筛选出的3株酵母菌可以有效地防治苹果青霉病,今后有望用于生产实践中[8]。采后病菌多通过果蔬伤口入侵,要有效地控制其繁殖,拮抗菌必须在伤口处具有较强的竞争力,应比病菌更适应于伤口的环境和营养状况。本实验表明,3株酵母菌在苹果伤口上均能迅速繁殖,这为其应用奠定了一定基础。
3株酵母菌的灭菌上清液和上清过滤液对苹果采后病害没有防治效果,而不同含量的酵母菌孢子悬浮液影响青霉病菌孢子的萌发,表明这3株酵母菌不是通过产生抑菌物质来抑制苹果青霉病的扩展,而可能是通过营养和空间竞争来起作用的,这与前人实验结果一致。Filnow用14C标记发现,Cryptococcus aurentii菌株(BSR-Y22)和Sporobolomyce sroseus菌株(FS-43-238)在苹果伤口处利用的糖比灰霉病菌多,因此营养竞争可能是主要的作用方式[9]。是否存在其他作用方式,如诱导抗性和溶菌酶(如β-1.3-glucanase和几丁质酶)产生等,还需进一步实验。 3 苹果采后炭疽病的化学防治技术
苹果炭疽病是苹果的三大病害之一，由于其潜伏侵染特性，不仅在田间危害，还
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Treatments 病斑直径
/mm
3.00c 4.94c 17.87b 17.93b 23.00a 19.93b
84.95 75.06 10.33 10.03 － －
2.75c 4.46c 17.81b 18.65b 22.50a 19.40b
85.82 77.31 8.19 7.21 － －
2.87c 4.71c 17.84b 16.29b 25.75a 18.17b
84.20 74.07 7.31 10.34 － －
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可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害。采后腐烂已是生产中的突出问题，据统计，我国每年果品采后损失约为20%－30%。减少采后损失是增加供给的一个有效途径。所以，实验苹果采后炭疽病的化学防治技术，可为苹果安全贮藏提供依据[10]。 3.1 杀菌剂对苹果炭疽病菌的影响 3.1.1 杀菌剂对苹果炭疽菌菌丝生长的影响
将杀菌剂分别配成含有效成分为0.1、1、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度，然后分别吸取1ml至培养皿，把已灭菌45℃左右的PDA培养基9ml加入含药剂的培养皿中，混匀凝固。移接一枚直径为5mm的小菌碟于其中央，置25℃培养，重复3次，逐日定时在菌丝生长前沿划线，按十字交叉法测量菌落直径，计算药剂对菌丝生长的相对抑制率。按最小二乘法求毒力回归式、EC50。 3.1.2 杀菌剂对苹果炭疽菌分生袍子萌发及芽管生长的影响
将杀菌剂分别配成含有效成分为0.1、1、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度，然后分别吸取1ml至培养皿，把尚未凝固的琼脂粉培养基9ml加人含药剂的培养皿中，混匀凝固。然后加人1×105个/ml分生孢子悬浮液25μg，置25℃培养箱中培养10h，用测微尺度量芽管的长度。重复3次[11]。计算分生孢子萌发率及芽管伸长抑制率。
袍子萌发率(%)=(袍子萌发数/共查孢子总数) ×100
芽管生长抑制率(%)=[(对照芽管长度－处理芽管长度)/对照芽管长度] ×100 3.2 化学药剂对苹果采后炭疽病的控制效果
3.2.1 不同施药浓度和方式对苹果炭疽病病斑扩展的影响
保护作用的测定:选择健康、大小一致的红富士苹果，用自来水洗净晾干，经75%酒精表面消毒，紫外线照射10min后备用。每处理30个苹果，处理后25℃恒温存放。分别用3种不同浓度的供试药剂喷雾或浸泡苹果。药剂处理后用1×105个/ml的分生孢子悬浮液针刺接种于苹果，接种时间分为药剂处理后立即接种和1、3、7天后接种。重复3次。治疗作用的测定:先用1×105个/ml的分生孢子悬浮液针刺接种于苹果，分别用3种不同浓度的供试药剂喷雾或浸泡苹果[12]。药剂处理时间分为接种后立即药剂处理和1、3、7天后药剂处理。重复3次。
防治效果(%)=[（对照病斑直径－处理病斑直径）/对照病斑直径] × 100 3.2.2 热处理与药剂结合对苹果炭疽病的控制效果
选择防治效果较好丙环唑、禾纹清、多菌灵配成150μg/ml的浓度，浸泡苹果，于36、42、50℃下处理10min，然后针刺接种1×105个/ml的分生孢子悬浮液，以未经药剂处理和未经热处理的为对照，25℃下保湿培养，重复3次，最后计算防治效果。
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