第一章
纳他霉素概述
纳他霉素早在1955年被Struyk等人发现，他们从南非纳他州的土壤中分离到的纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）培养液中分离出了一种新的抗真菌物质，当时称为Pimaricin（匹马菌素）；4年后美国人Burns等从土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis，并从其培养物中分离到了Tennecetin（田纳西菌素）。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被世界卫生组织WHO统一命名为纳他霉素（Natamycin）。
第一节 纳他霉素的性质
一、纳他霉素的分子结构
纳他霉素为四烯大环内酯，四烯系统呈全顺式，内酯环上C9－C13部位为半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖（Mycosamine）。其化学结构式如图1-1所示。纳他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数pKa值分别为8.35和4.6，等电点为6.5，熔点为280℃。纳他霉素存在两种构型：烯醇式和酮式，这就使得其难溶于多种溶剂。
图1-1 纳他霉素的分子结构
二、纳他霉素的理化性质
纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌物质，呈白色或乳白色结晶粉末，含3个结晶水，几乎无臭无味。分子式为C33H47NO13，分子量为665.75。纳他霉素的紫外光谱如图1-2所显示，分别在290nm、303nm、318nm处有强吸收峰，280nm处有峰肩，220nm处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因此在280～320nm之间出现吸收峰，而在220nm的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团。纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族形式保持弱氧化性，纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出
碘。纳他霉素酸解可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过 图1-2 纳他霉素的紫外光谱 碱水解作用皂化。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性 随着pH的降低或升高而增加，中性时溶解度最低，而在pH低于3或高于9时溶解度增大。纳他霉素在各种常见溶剂中的溶解度如表1-1所示。
表1-1 纳他霉素的溶解度
溶剂 水 乙醇
乙醇80%+水20% 甲醇
溶解度% 0.005~0.01 0.01 0.07 3.3
丙二醇 甘油 二甲基亚砜 冰醋酸
1.4~2.0 1.5 5.0 18.5
纳他霉素干粉在避光避潮下较稳定，室温下保存几年只有很小一部分失活。其三水合物同样稳定，但其无水形式不稳定，在室温封闭的瓶子中保存48小时失去15%的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素的稳定性受pH值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响。
纳他霉素在pH4.5～9之间非常稳定，在极端pH值下纳他霉素迅速失活，形成不同的分解产物。低pH值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；高pH值时，如pH12，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步分解，产生一系列的后醛醇反应。pH对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。纳他霉素在pH5~7的范围内，30℃储存三周，其活性仍保持100%，pH3.6时保持大约85%，pH9.0时大约为75%，但在大部分食品所在的pH范围内，纳他霉素十分稳定。
纳他霉素的稳定性好，50℃放置几天或100℃短时处理，其活性几乎无损失。120℃条件下加热不超过1h仍能保持部分活性。
纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。γ辐射也能使纳他霉素分解。纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下降。一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加EDTA或聚磷酸盐来防止失活。
第二节 纳他霉素的生理功能和毒理性
一、纳他霉素的抑菌功能
纳他霉素是一种广谱抗生素，对霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类有抑制作用（表1－2），但对细菌没有抑制。纳他霉素的抑菌机理一般认为是：真菌的细胞膜含有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选择的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜-多烯化合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物质的泄漏。纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于休眠细胞则需要较高的浓度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。有人测试过纳他霉素对500种霉菌的抗性，所有菌种都被1～10mg/L的纳他霉素抑制。Klis比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对16种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在0.5～6mg/L的纳他霉素浓度下被抑制，极个别霉菌在10～25mg/L的纳他霉素浓度下被抑制，1.0～5.0mg/L的纳他霉素能抑制多数酵母。
表1-2 纳他霉素对常见微生物的抑制作用 微生物名称 梨头霉菌 链格孢菌 黑曲霉
灰质葡萄孢菌
MIC（mg/L） 25.0 10.0 5.0 1.0
镰刀菌 蜂毛霉菌 乳念珠菌 指状青霉菌 膨大青霉菌 青霉菌 根霉菌
细小红色根隐球菌 啤酒酿酒酵母菌 镰刀麦角菌 红色凸孢子菌
伯克力孢子酿酒酵母 酒香酵母菌 白色念珠菌 吉利蒙氏念珠菌 维尼氏念珠菌 多形汉逊氏酵母菌 针峰状克勒克氏酵母菌 贝尔氏酿酒酵母菌 拜也努氏酿酒酵母菌 啤酒酿酒酵母菌（8021） 啤酒酿酒酵母椭圆形变种 少孢酿酒酵母
路德维希氏酿酒酵母菌 鲁氏酿酒酵母菌 萨克氏酿酒酵母菌 念珠样串酵母菌 凝聚孔串酵母菌 10.0 5.0 10.0 5.0 10.0 1.0 5.0 5.0 5.0 3.0 5.0 5.0 1.5 1.5~2.0 3.00 1.00 1.00 3.00 1.00 1.00 2.50 2.50 2.50 2.50 5.00 5.00 2.00 3.00
二、纳他霉素的毒理性
纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。人体口服500mg纳他霉素后，在血液中的含量少于1mg/mL，即说明纳他霉素很难被动物或人体的肠胃吸收。有研究表明，奶牛食入的高剂量的纳他霉素，约90%经粪便排出。急性和慢性毒性试验证明，纳他霉素对人体器官没有明显影响，不产生伤害。Hamilton报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。De等人研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使用大于MIC(最低有效抑制浓度)的纳他霉素量，人为诱导也没有发现真菌形成抗性的证据。Ray等人报道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄曲毒素、赭曲霉产生的赭曲毒素、圆弧青霉产生的青霉酸、展开青霉产生的展开青霉素。经卫生学调查和皮肤斑点试验，表明纳他霉素无过敏性反应。经降解处理后的纳他霉素在急性毒理、短期毒性实验中均无对动物的损害。耐药性的研究表明，未见有霉菌和酵母对纳他霉素有异常的耐药性。
美国FDA建议纳他霉素作为食品添加剂使用的抗生素，还被归类为GRAS产品之列。我国于1996年由食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为霉克（NatamaxinTM）。美国CFR编码：21CFR172.155，其中
对纳他霉素的DAI值是0.3mg/kg，根据我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）规定，食物中最大残留量是10mg/kg，而纳他霉素在实际应用中的使用量为微克级。
第三节 纳他霉素发酵的国内外发展动向
早在1960年已有发酵生产纳他霉素的报道。但直到20世纪九十年代，纳他霉素的生产研究才重新受到关注。期间，关于纳他霉素发酵与提取等方面都有了深入的研究。目前，国外对纳他霉素产生菌基因工程方面的研究已经起步。1999年Aparicio等人研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的生物合成基因簇，染色体组包含110Kb碱基对。他们还报道了由功能基因分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因pimS0和pimS1，pimS0编码一个相对较小的乙酸激活聚酮合酶（PKS）基因（大约193kDa），pimS1编码一个巨大的多酶基因（大约710kDa）。
2000年Aparicio等人报道了纳塔尔链霉菌的一个含16个开放读码框（表1-3），84985bp基因簇的序列，它是继制霉菌素后报道的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶（PKS）的13个同源酶基因，PKS被分配在五个巨大的多酶系统中（PIMS0-PIMS4）。同年，Marta等人又研究报道了纳塔尔链霉菌中的一个隐蔽质粒pSNA1的基因图谱和全部核苷酸序列，DNA分子大小9367bp，G+C的含量占71.3%，拷贝数30。pSNA1包含七个开放阅读框，分别编码不同的蛋白质。
2001年，Marta等人报道了从纳塔尔链霉菌中获得的目的基因片段pimD，它编码细胞色素P450环氧酶，负责将4,5-去环氧匹马霉素（4,5-de-epoxypimaricin）转变成匹马霉素。4,5-去环氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的一个重组突变体中分离得到的。
表1-3 纳他霉素生物合成基因簇ORFs及结构域
ORFs
多肽 PIMS0 loading 组件0 PIMS1 组件1 组件2 组件3 组件4 PIMS2 组件5 组件6 组件7 组件8 组件9 组件10 PIMS3 组件11 PIMS4 组件12
氨基酸 1847 6797 9507 1808 2024
PKS Col PKS PKS PKS PKS
*KS KS KS KS KS KS KS KS KS KS KS KS KS
Ata Ata Ata Ata Ata Ata Ata Atb Ata Ata Ata Ata Ata
结构域 DH DH DH DH DH DH
KR KR KR KR KR KR KR KR * KRKR KR KR
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
ACP TE
pimS0
pimS1
pimS2
pimS3
pimS4
pimA pimB pimC pimD pimE pimF pimG pimH pimI pimJ pimK
PimA PimB PimC PimD PimE PimF PimG PimH PimI PimJ PimK 602 626 352 397 549 63 398 432 255 343 458 转运ABC 转运ABC 氨基转移酶
细胞色素P—450单氧化酶 胆固醇氧化酶 铁氧还蛋白
细胞色素P—450单氧化酶 流量泵 硫酯酶 糖脱氢酶 糖基转移酶
第二章 纳他霉素的发酵生产
第一节 纳他霉素的生物合成途径
多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分为三个步骤：活化前体的生成（乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A）、内酯大环的生物合成（多聚乙酰途径）和氨基糖的形成。如图1-3所示。由于纳他霉素生物合成代谢调控以及前体物质在其合成中的作用方面的报道甚少，因此，已有的报道更多的是基于多烯大环内酯抗生素生物合成途径来进行代谢调控。
第二节 纳他霉素发酵及菌种选育
一、纳他霉素发酵微生物 图1-3 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径
纳他霉素产生菌为链霉菌,链霉菌的基内
菌丝通常发育良好,多分枝、无隔膜而连贯，气生菌丝茁壮，较基内菌丝粗，颜色较深,当菌丝逐步成熟时,大部分气生菌丝分化成孢子丝,产生呈长链的孢子，孢子被外鞘所包，鞘表面平滑或带各种装饰物,在电子显微镜下表现为双短杆镶嵌状,有鳞片或形状和大小不同的突起、刺或毛发等；孢子的分裂方式也有差异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残余的鞘相连。目前，报道的纳他霉素生产菌有三种：
1、恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanovgensis，ATCC 13358，其形态特征为孢子丝圈至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。
2、纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis，ISP 5357，其形态特征为孢子丝2～5圈松敞螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。
3、褐黄孢链霉菌Streptomyces gilvosporeus，ATCC 13326，其形态特征为孢子丝螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。
二、纳他霉素发酵菌种选育