Ⅰ、微生物学实验室常用的器皿
微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。 一、器皿的种类、要求与应用 1．试管（test tube）
微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。
（1）大试管（约18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。
（2）中试管（约13—15×100—150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。高等医学院校实验教材 医学微生物与免疫学 实验指导 主 编 韩 莉
副主编 张昌菊 宋利琼 编 者 (以姓氏笔画为序) 王 磊 朱 平 刘 嘉 刘 英 宋利琼 吴红艳 杨建林 周永芹 张 颖 张昌菊 韩 莉
三峡大学医学院生物病原部 2005年6月29日
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第一篇 医学微生物学
实验室规则 ???????????????????????????2 实验一 常见细菌形态学检查方法(综合性实验)???????????3 实验二 细菌的分离培养法与消毒灭菌(综合性实验) ????????11 实验三 化脓性球菌的分离鉴定(设计性实验) ???????????27 实验四 肠道杆菌的分离鉴定(设计性实验) ????????????32 实验五 厌氧菌,分支杆菌的检查法(综合性实验) ?????????41 实验六 各种微生物形态,病毒学检查法(综合性实验) ???????46 微生物学各论自学提纲 ?????????????????????56 第二篇 医学免疫学
实验一 天然免疫功能的检测(综合性实验) ????????????60 实验二 常见抗原抗体反应(综合性实验) ?????????????67 实验三 细胞免疫检测I:细胞因子的检测(设计性实验)???????86
实验四 细胞免疫检测Ⅱ:淋巴细胞分离,计数及活性检测(设计性实验)???94
实验五 细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖实验(设计性实验)?????103 综合复习 ???????????????????????????107 附录 ?????????????????????????????113 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 32
实验一,常见细菌形态学检查方法 (综合性实验) 【实验内容】
一,细菌涂片制作及革兰氏染色法. 二,细菌的基本形态与特殊结构观察. 三,细菌动力的观察(悬滴法). 四,显微镜油镜的使用和维护. 五,电镜观察细菌的菌毛. 【目的要求】
一,初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术. 二,认识细菌基本形态.
三,了解细菌特殊结构及其与医学实践关系. 四,初步掌握油镜的使用和维护.
五,了解电镜在医学微生物学研究中的应用. 【实验原理】 一,革兰染色法
细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术.由于细菌个体微小,无色半透明,在普 通光学显微镜下不易清晰观察,一般需经染色来增加反差,从而有利于对细菌标本的观察. 染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料.在一般生理条件下 (pH 7.4左右),细菌菌体都带负电荷,故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯 胺染料,如美蓝,结晶紫,碱性复红等,它们较易与细菌菌体结合.
染色方法可分单染色法和复染色法两大类.前者只用一种染料染色,只能观察细菌的
形态和排列,不能显示细菌结构及染色反应性;后者是以两种以上的染料染色,可显示出细 菌的特殊结构或染色反应性能,在细菌的鉴别上有一定意义,其中最常用的为革兰染色法. 细菌革兰(Gram)染色是最常用的细菌鉴别染色法,首先由Gram创用而得名.细菌染
色后不仅可区别其形态和排列方式,还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴 性菌两大类;不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌(G+菌),被酒精脱色后复染成红色 者为革兰阴性菌(G-菌).革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别,同时还为分析细菌的致病性 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 33
和选用抗菌药物提供了依据.
革兰染色的原理目前存在三种假说:
1.通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易 透入;革兰阴性菌细胞壁结构疏松,肽聚糖层薄,含大量脂质,乙醇易渗入. 2.等电点学说 革兰阳性菌等电点(pI 2～3)比革兰阴性菌(pI 4～5)低,在相同
pH条件下,革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多,故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固, 不易脱色.
3.化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐,可与碘,结晶紫牢固结合,使已 着色的细菌不被乙醇脱色;革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少,故易被脱色. 在细菌标本染色前,必须将细菌固定在载玻片上,常用的固定方法为加热法, 其目的是杀死细菌,且保持原有形态,并使细菌粘附在载玻片上,不致染色时脱
落.
二,细菌的基本形态和特殊结构观察
细菌形体微小,且为无色半透明,必须经过适当的染色,经显微镜(如图1)放大1000 倍才能观察清楚,故须用油镜观察.
使用油镜时,要在标本上滴加香柏油,其目的是增加进入透镜的光线,使视野明亮度 加强,物象才看的清楚.原理为:透镜的孔径小,进入的光线先通过标本玻片,再通过透镜 与油镜头之间的空气,然后进入油镜头.由于玻片与空气折射率不同,光线通过两种折射率 不同的介质,就会发生折射(如图2),以至进入油镜头的光线不够强,致使物象不清晰. 当油镜头与玻片之间加香柏油后,由于香柏油的折射率(1.515)和玻璃的折射率(1.52) 相仿,因此,进入透镜的光线增加了(如图2).视野明亮度加强,物象也就看得清楚了. 目镜 物镜转换 物镜 标本推进 载物台 光圈 集光器 反光镜 镜座 标本推 进器旋 细调节轮 粗调节轮 镜臂
图1 普通光学显微镜的结构
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细菌的基本形态可分为球菌,杆菌和螺形菌三类.球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列 情况又分为双球菌,链球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌等;杆菌也有球杆菌,链杆菌, 分枝杆菌,棒状杆菌等之分;螺形菌中菌体仅有一个弯曲,呈逗点状者叫弧菌,菌体有2～ 3个弯曲,且较僵硬者为螺菌.某些细菌除了有细胞壁,细胞膜,细胞浆和核质这些基本结 构外,还具有其他特殊结构,包括荚膜,鞭毛,菌毛和芽孢.这些特殊结构有着各自的不同 意义.
三,细菌动力的观察(悬滴法)
许多杆菌,弧菌具有鞭毛,有动力,在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地
方.一般球菌无鞭毛,没有动力,但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的 颤动.
四,电镜观察细菌的菌毛
电子显微镜是根据电子光学原理,用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜,使物质的 细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器.
电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示.20世纪70年代,
透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米).现在电子显微镜 最大放大倍率超过300万倍,而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍,所以通过电子显 微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子. 【实验材料与仪器】
一,无菌牙签,革兰染色液(结晶紫染液,碘液,95%酒精,复红染液),生理盐水,载玻片,
冲洗用具等
二,普通光学显微镜,香柏油,二甲苯,擦镜纸 玻片透镜 香柏油
图-2 油镜的原理
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三,球菌,杆菌,螺形菌及特殊结构示教片
四,葡萄球菌,变形杆菌幼龄(8～12小时)肉汤培养物,凹玻片,盖玻片, 凡士林等 五,电镜H-7500,放大倍数20～60万倍,最大分辨能力0.204 nm 【实验方法与步骤】
一,细菌涂片制作及革兰氏染色法 1.制片:
⑴ 涂片:取清洁玻片一张,在玻片的中央滴一小滴生理盐水(滴加生理盐水不宜过多). 用无菌牙签挑取牙垢少许,与玻片上的水滴混匀,涂布成一厘米大小的均匀薄膜. ⑵ 干燥:将涂片放室温中自然干燥,切勿紧靠火焰烘烤,以免标本烤焦,损害菌体结 构.
⑶ 固定:持玻片一端,标本面向上,迅速通过火焰三次(约2～3秒),以玻片温度
达到皮肤能耐受的温度为宜.固定的目的是杀死细菌,使其固定于玻片上,并能增强细菌对 染料的通透性. 2.革兰染色:
⑴ 初染:将已固定的涂片标本,加结晶紫染液于涂面上染色1 min,然后水洗. ⑵ 媒染:加革兰氏碘液媒染1 min,水洗.
⑶ 脱色:滴加95%酒精,频频摇动载玻片,斜持载玻片,使脱下的染液流下,再次滴 加酒精脱色,直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止,水洗.
⑷ 复染:用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min,水洗,自然干燥或吸水纸印干. 3.观察结果:
用油镜观察染好后的标本片,记录所见结果,染成紫兰色者为革兰氏阳性菌,染成红色 者为革兰氏阴性菌. 注意事项
1.玻片一定要清洁无油.
2.加生理盐水切莫贪多以免难于干燥,涂片要均匀且薄. 3.固定标本时切勿过热,以免菌体变形.
4.要掌握好染色时间,尤其是酒精脱色的时间,不宜过长或过短,以脱色至涂片为灰 色为宜.
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5.水洗时要以细流水徐缓冲洗,否则会将玻片上的标本冲掉.
二,细菌的基本形态与特殊结构观察 1.方法
(1)使用显微镜油镜,观察各种球菌,杆菌和螺形菌以及细菌特殊结构的示教片,比 较各菌的形态,大小,排列和特殊结构特点.
(2)绘图:将观察到的结果画在报告纸上并加以适当的描述. 2.结果
(1)细菌基本形态的观察
①球菌:见排列方式不同的各种球菌,而且革兰染色性亦不同.
②杆菌:大肠杆菌为革兰阴性的短杆菌;炭疽杆菌为革兰阳性杆菌,可见菌体粗大, 两端平齐,酷似竹节状.
③弧菌:弧菌为革兰阴性菌,菌体略带弯曲,呈逗点状或括弧形,霍乱弧菌涂片染 色可出现\\\鱼群状\\\的排列特点. (2)细菌特殊结构观察:
① 肺炎链球菌(荚膜):肺炎链球菌为革兰阳性菌,成双排列.在双球菌体外围有 一层较厚的透明区域,即为荚膜.
② 变形杆菌(鞭毛):变形杆菌为革兰阴性菌,通过鞭毛染色,可见菌体周围有细 长弯曲的数根丝状物,即为鞭毛.
③ 破伤风梭菌(芽孢):破伤风梭菌为革兰阳性菌.经芽胞染色后,可见菌体顶端有
一圆形,比菌体宽的结构,即为芽胞.芽胞与菌体相连形似鼓槌状,在细菌中为独有的形态. 肉毒梭菌菌体次极端有一椭圆形,比菌体宽的芽胞,与菌体相连,形似网球拍状. 三,细菌的动力观察(悬滴法)
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图3 细菌的动力观察(悬滴法)制片方法
1.取凹玻片两张,在凹窝周围涂抹少许凡士林.
2.各取一接种环的变形杆菌,葡萄球菌幼龄培养物,分别放于两块盖玻片中央. 3.将凹玻片反转.使凹窝对准盖玻片中心,覆于其上,粘住盖玻片后再反转.以接种 环柄轻压盖玻片,使与凹窝边缘粘紧.
4.先以低倍镜找至悬滴的边缘后,再换用高倍镜观察(因凹玻片较厚,油镜焦距很短, 故一般不能用油镜来检查).
5.观察时,注意比较变形杆菌和葡萄球菌的运动情况有何不同. 注意事项
1.观察悬滴标本时,先用低倍镜找到悬滴的边缘,然后将视野移至悬滴中央,将集光 器下降,缩小光圈,使亮度减弱,再用高倍镜观察,否则亮度太强,不好观察. 2.调节螺旋时,切忌过度下旋,以免压碎盖玻片. 3.用接种环在试管中取材的方法(如图4):
(1)左手拇指,食,中三指持试管底,右手拇,食,中三指握笔式持接种环,并垂直 于火焰上烧灼至发红为止.移至火焰旁待冷.
(2)在火焰附近用右小指夹取试管上的棉塞,移动后轻轻拔出,并持于小指与小鱼际 之间,不得将棉塞放置桌上或触及任何物品.
(3)将试管口移至火焰上旋转烧灼,灭菌后移至火焰附近,用冷却后的接种环插入试
管内取少许生理盐水(若为液体则沾取一环菌液后退出),接种环不可与试管壁接触,以免 环上生理盐水碰落.取出后立即将管口在火焰上转动灭菌后塞上棉塞.接种环使用后经烧灼 灭菌插入试管架上.
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图4 接种环在试管中取材的方法 四,油镜的使用和保护 1.光源的采用