福建农林大学课程论文
植物组织培养课程论文
题 目： 石斛属植物的遗传转化及研究进展 学 院： #######学院 专 业： ###### 学生姓名： #### 学号：########## 完成时间： ##### 年 # 月 # 日
1
福建农林大学课程论文
石斛属植物的遗传转化及研究进展
摘要: 石斛作为一种集药用和观赏于一体的珍稀植物,近年来其组培快繁和基
因工程研究取得了比较大的进展。综述了石斛属植物组织培养技术在石斛增殖快繁、遗传转化方法、选择标记基因和报告基因等方面的研究进展,为石斛的开发和利用提供科学依据。
关键词：石斛，组织培养，遗传转化,发展与展望
1.石斛简介
1.1，[1]石斛，兰科植物之一，主要分布于亚洲热带和亚热带，澳大利亚和太平洋岛屿，我国大部分分布于西南、华南、台湾等地。石斛兰的主要品种有金钗石斛、密花石斛、鼓槌石斛等。可入药，名为石斛，对人体有驱解虚热，益精强阴等疗效。随着花卉产业的兴起，石斛兰也成为了一种观赏植物。石斛兰的栽培方式一般为盆栽。由于石斛兰具有秉性刚强、祥和可亲的气质，被誉为父亲之花。石斛兰的植株由肉茎构成，粗如中指，叶如竹叶花葶从叶腋抽出，每葶有花七八朵，每花6瓣，四面散开，花瓣边均为紫色，瓣心为白色。
1.2生物学特性：[2]石斛属为兰科中最大的一个属，包括约1500种植物，主要分布于热带亚洲和太平洋岛屿。我国约63种石斛属植物，目前供作药用的石斛属植物39种。国产石斛分布于秦岭、淮河以南，从纬度而言，大多数种类都集中在北纬15°30′～25°12′之间，向北种类逐渐减少，最北界不超过北纬34°24′。从垂直看，海拔100～3000米的高度都有分布。石斛属植物是以热带东南亚中心向着亚热带性气候条件发展的类群，我国的云南、广西、广东、贵州、台湾为国产本属植物的分布中心。
石斛属植物为附生植物，生境独特，对小气候环境要求十分严格。多生于温凉高湿的阴坡、半阴坡微酸性岩层峭壁上，群聚分布，上有林木侧方遮阴，下有溪沟水源，冬春季节稍耐干旱，但严重缺水时常叶片落尽，裸茎渡过不良环境，到温暖季节重新萌发枝叶。常与地衣、苔藓植物以及抱石莲、伏石蕨、卷柏、石豆兰等混生。石斛以其密集的须根系附着于石壁砂砾上吸收岩层水分和养料，裸露空中的须根则从空气中的雾气、露水吸收水分，依靠自身叶绿素进行光合作用。因此，石斛受小气候环境中水分，尤其是空气湿度的严格限制，分布地域极为狭窄。
2.石斛的组织培养技术
2.1 外植体的选取：
在石斛属植物组织培养中，常以幼胚、种子、冬芽、叶片、叶柄为外植体。[3]用饱满冬眠顶芽作为外植体诱导出芽体。[4]对石斛春季的萌动芽进行诱导，培养一段时间后，每个外植体可长出10~15个丛生芽。采取在春季采取新萌发的嫩芽接种培养，均可获得完整植株。将石斛带子叶的顶芽接种于培养基中，20 d
2
福建农林大学课程论文
左右可产生不定芽。将石斛消毒后剥去最外层，从中轴纵切成4份接入培养基，20 d后明显可见愈伤组织，诱导率达90.3%。[8]以石斛叶片及叶柄为外植体，诱导产生愈伤组织，发现叶片的诱导率低于叶柄，愈伤组织能分化产生不定芽；此外，外植体也可不经过愈合组织阶段而直接分化产生不定芽。有种子[5-6]、茎段[9|、茎尖[13]、腋芽[14]14、根尖[15]15、叶[16]及试管苗[7]等。在药用植物组织培养中，外植体的选择十分关键，不同的取材部位和取材时期，培养的结果也不一样。张艳等[7]以金钗石斛取材部位、基本培养基、激素浓度配比因素进行正交试验，结果表明，取材部位是最敏感的因素。卢文芸等ll刮用环草石斛的茎段在MS培养基中培养，研究了不同取材的位置对环草石斛出芽的影响，结果表明，茎尖部位明显要高于其他部位，茎中部次之，而茎基部几乎不能萌发；茎段外植体苗比种子苗成株快，茎粗，苗壮，易成活；外植体苗分段增殖时基部茎段的增殖系数比上部茎段大，生长速度快；继代增殖苗段比野生植株增殖快。
2.2组培中常用转基因方法
2.2.1基因枪法，这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。[17]基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。
2.2.2农杆菌介导法，农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
2.2.3花粉管遂道法，在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
3.石斛的遗传转化
3．1转化方法：
目前报道的石斛的遗传转化主要通过2种法应用较多，成功率也较后者高一些。Chang等四J将兰花花叶病毒(cMv)外壳蛋白(CP)基因用微粒轰击石斛的原球茎的方法进行基因转移，在含有潮霉素的培养基上选择转株，PCR、Southem、Northem以及Western杂交分析证实了转基因的存在；病毒侵染试验表明，转化株的症状明显低于非转化株。石斛基因工程研究缓慢，主要因为兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感，缺乏合适的表达载体。Yu等恻首先将经薄层切片处理的类原球茎与农杆菌在无抗生素的培养基上共培养，卡拉霉素用于石斛兰转
3
福建农林大学课程论文
化子的筛选，选择培养6～8周后得到转基因植株。遗传转化主要以原球茎或愈伤组织作为靶材料。原球茎易诱导，转化后也易分化成苗，但原球茎遗传转化后易产生嵌合体，不利于鉴定筛选。Tee等[18]使用不同类型的愈伤组织及离体诱导的花序顶端组织作靶材料对石斛兰中的一个种Sonial7进行转化，GFP的表达率都较高，但后期培养中，以花序顶端组织为靶材料轰击的个体成活率低。
3．2选择标记基因及报告基因：
石斛遗传转化中常用的选择标记基因有潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)E303，选择培养中使用潮霉素(nyg)作为选择剂。Men等[19]。建立了稳定的农杆菌介导转化原球茎的方法，使用hpt基因作为标记基因转化金钗石斛，转化效率高达18％；Southem杂交和CUS组织化学分析也表明了基因的整合与表达。GUS具良好的稳定性，灵敏度高，易于检测，是目前植物基因工程研究工作中使用最广泛的一种报告基因lm引。近年来，绿色荧光蛋白基因(GFP)作为一种新型的报告基因开始在植物基因转化及基因表达调控研究中得到应用，并显示出较其他报告基因更大的优越性：无需底物、酶、辅因子等物质；便于活体检测；检测时只需光照，对细胞无毒害作用。
4.石斛研究展望
石斛植物中含有多种生物碱、抗癌菲、类黄酮等物质，组织培养过程中次生代谢产物的研究对石斛尤为重要，以便通过生物技术获取这些药用成分。深入了解次生代谢产物的产生及积累动态，通过调控培养条件、添加前体化合物等方法提高活性成分的产量，以探讨组织培养物代替药材通过调控培养条件、添加前体化合物等方法提高活性成分的产量，以探讨组织培养物代替药材使用的可能性；或者建立有效的生物反应器，直接生产活性成分，能有效解决药用石斛资源短缺。通过遗传转化，导入花色、花期、株型等目的基因，一方面可以提高和改善石斛兰的观赏价值，另一方面可以创造新品种，为石斛兰提供了丰富的育种资源。石斛组织培养和基因工程也存在很多问题，试管苗移栽成活率有待进一步提高；生长十分缓慢，周期长，规模小，成本高；石斛对农杆菌敏感性差，转化率低；基因枪转化嵌合体较多等等。总之，随着石斛组织培养技术的完善，基因工程改良石斛品种技术的成熟以及工业化生产技术的发展，这些问题将逐步得到解决，有望缓解当前石斛用量大、植物资源匮乏的紧张状况。我国石斛兰产业发展较晚，从 20世纪 90年代才开始规模化生产 ，虽然发展速度很快，但是仍存在诸多问题：生产类型单一 ，主要以盆花为主，微型花卉和切花都极少生产 ，且盆花品种匮乏，已不能满足市场多元化的需求 ；育种工作滞后 ，生产和销售的观赏石斛兰基本上都是驯养的野生石斛兰和进 口品种。为了能够让我 国的石斛兰产业迅速发展 ，首先应当加强对野生石斛兰资源的保护、开发与利用 ，加强和深化对石斛兰的育种研究 ，提高育种水平 ，培育出观赏价值高、具有 自主知识产权的新优品种 ，进而促进生产和科研有机结合 ，使生产企业能够积极栽培我国自我培育的有市场前景的新优品种。
参考文献：
[1]朱艳，秦民坚．铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究[J]．中国野生植物资 源，2004，22(2)：56—57．
4
福建农林大学课程论文
[2]吉占和．中国石斛的初步研究[J]．植物分类学报，1980，18(4)：427—449． [3]傅玉兰，张志平，姚萍．春石斛组培快繁技术研究[J]．安徽农业科学， 2006，34(3)：464—465．
[4]陈晓梅，郭顺星．石斛属植物4Jc学-成分和药理作用的研究进展[J]．天 然产物研究与开发，2001，13(1)：70—75．
[5]丁长春．齿瓣石斛的胚培养技术及其快速繁殖研究[J]．热带农业科 技，2004，27(3)：10—11．
[6]陈之林，曾宋君，段俊．独角石斛的离体繁殖[J]．植物生理学通讯， 2004，40(3)：342．
[7]傅玉兰，谷凤，胡传明，等．霍山石斛组培快繁技术研究[J]．安徽农业 科学，2004，32(3)：522—523．
[8]周俊辉，钟雪锋，蔡丁稳．铁皮石斛的组织培养与陕速繁殖研究[J]．仲 恺农业技术学院学报，2005，18(1)：23—26．
[9]孙廷，杨玉珍，陶杰，等．金钗石斛的组织培养和快繁技术[J]．山东农 业大学学报：自然科学版，2005，36(1)：47—50．
[10]卢文芸，唐金刚，乙引，等．五种药用石斛快速繁殖的研究[J]．种子， 2005，24(5)：23—25，28．
[11]孔琼，袁盛勇，查应洪，等．梳唇石斛成熟胚的离体培养和植株再生 [12]植物生理学通讯，2005，41(5)：644．
[13]张启香，方炎明．铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结 构观察[J]．西北植物学报，2005，25(9)：1761—1765．
[14]付志惠，李洪林，杨波．广东石斛的组织培养[J]．植物生理学通讯， 2005，41(4)：491．
[15]詹忠根，徐程，张铭，等．铁皮石斛离体根尖经体细胞胚再生植株研究 [16]浙江大学学报：农业与生命科学版，2005，31(5)：579—580．
[17]张治国，刘骅，王黎．铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J]．中草 药，1992，23(8)：431—433．
[18]曾宋君，程式君．石斛的试管苗快速繁殖[J]．中药材，1996，19(10)：490—491．
[19]蒋波，杨存亮，黄捷，等．铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究。
5