不同浓度的三种精油对香菇POD、CAT及POD活性的影响
食品质量与安全 2009级 叶昕轶
指导教师 秦文 教授
摘要：研究了不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油对香菇保藏过程中菇体内的多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)酶活性的影响。探究这三种精油储藏香菇的最适浓度。实验结果：丁香精油具有较强的抗氧化和护色能力，肉桂精油次之，百里香精油抗氧化作用不强。综合三项酶指标与色泽和腐烂指数，储藏香菇的三种最适精油及浓度分别是：20μl/L的肉桂精油、10μl/L的百里香精油和10μl/L的丁香精油。 关键字：香菇、肉桂精油、百里香精油、丁香精油、多酚氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶
Effect of three different concentrations of Essential Oils on Polyphenol Oxidase,Catalase and Peroxidase in Lentinus Edodes
Food Quality and Safety, Grade 2009: YE Xin-yi
Instructor: Professor Qin Wen
Abstract: The effects of different concentrations of cinnamon oil, thyme oil and clove oil on the preservation process lentinus edodes of polyphenol oxidase(PPO),Catalase(CAT) and Peroxidase(POD) enzyme activity. To explore optimal concentration essential oil to storage lentinus edodes. The results showed that: Clove essential oil has strong antioxidant capacity and color protection, the second is cinnamon essential oil, thyme oil antioxidant effect is not strong. Integrated three enzyme targets with color and decay index, three kinds of best oils and concentrations were: 20μl/L of cinnamon essential oil, 10μl/L of thyme essential oils and 10μl/L of clove oil.
Keywords: Lentinus Edodes；Cinnamon oil；Thyme oil；Clove oil；Polyphenol Oxidase；Catalase；Peroxidase
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1 前言
香菇(Lentinus Edodes)又名香菌、冬菇。其营养丰富，产量大，市场广，栽培技术成熟，还有一定得保健功能和药用价值。例如，能促进人体对钙的吸收，可防止佝偻病，香菇素可降低人体内胆固醇含量，而香菇多糖可提高人体免疫功能，且具有保肝、防癌抑癌等作用，因此深受人们喜爱，是国内重点研究的抗癌资源植物之一[1, 2]，被誉为“菇中之王”[3, 4]。然而，采摘后的新鲜香菇，一方面旺盛的生理活动，导致菌伞开裂、褐变、老化而使营养物质快速消耗[5]；另一方面，香菇水分含量高，容易受到微生物的侵染而发生褐变和腐败，致使商品率降低[6]。在储藏过程中如何有效保持鲜香菇的品质，备受关注[7]。
冷藏保鲜、气调保鲜法和化学保鲜法是目前果蔬保鲜的主要方法，但这些方法存在一些不足，如低温冷藏可能导致果蔬产生冷害，且能耗较高；气调保鲜对设备要求较高，且气体组分的波动影响保鲜效果；化学杀菌剂的残留危害人类健康或产生抗药性，人们对食品安全的关注程度越来越高，研制无公害高效防腐保鲜剂成为迫切的需要。研究表明植物提取物中含有抑制病原微生物的成分，人们提出了利用植物中的抗菌物质对果蔬采后病害生物防治的设想并进行了大量研究[8]，植物精油类防腐保鲜剂成为一个研究热点[9-11]。
植物精油(Essential Oils，EOs)是具有较强挥发性的植物次生代谢产物，一般从中药和香辛料中提取，可用于食品、药品和化妆品行业，有杀虫、抗菌、抗真菌、抗氧化和抗癌的作用，获得了美国食品药物管理局安全的认可[12, 13]。目前，精油作为一种天然的绿色农药、环境友好型的生物防治试剂应用于果蔬[14, 15] 、肉类[16]、蛋[17]等的防腐保鲜中，有较为明显的效果[18-20]。国内外的学者在天然提取物在果蔬保鲜上的应用研究也较多[10]，如潘磊庆[21]等报道了丁香精油可诱导樱桃番茄的防御性酶活性升高。曾晓房[22]等研究得出肉桂精油对紫金春甜柑的贮藏保鲜有积极作用。王建清[23]报道，百里香精油对鲜切冬瓜具有明显的抑菌作用。精油类防腐保鲜剂被认为是食品添加剂研究领域最有前景的发展方向，是开发新型高效果蔬生物防腐保鲜剂的重要途径。然而，精油对香菇的影响研究，鲜有报道，而通过查阅大量文献发现对果蔬采后病原菌抑制作用较强的植物主要有丁香、上苍子、百里香、肉桂、高良姜等。丁香既是香料又中药，具有抑菌作用，易挥发，无残留[24]，国内已有学者研究了丁香精油对果蔬的保鲜效果[15, 25, 26]。肉桂精油是一种林特产品[27]常用于饮料、糖果、香烟等食品[28, 29]。百里香精油具有很好的抑菌作用，其主要抑菌成分为百里香酚和香芹酚[30]。美国食品药品监督管理局(FDA)将百里酚和百里香植物都列为食品添加剂
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[31]
，安全系数高。三种精油极具代表性，因此本实验选择了丁香、百里香、肉桂三种精油
作为供试精油。
而之所以选择香菇多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)作为实验指标，是因为他们是香菇在采后的生理过程中主要的活性酶。其活性与抗病性有较密切的关系。PPO是导致香菇子实体褐变的主要酶，催化各种酚类物质氧化成醌类，再聚合成黑色素，酶活性被抑制有利于保持香菇的颜色、风味、营养[32]。而细胞内存在CAT、POD等抗氧化酶类，有清除活性氧自由基的能力，能在一定程度上对氧自由基的损害形成保护，酶活性被诱导有利于保持香菇性状和品质。本文重点探究三种精油的对香菇抗氧化特性的影响，为研究开发果蔬生物防腐保鲜剂提供借鉴。
2 材料与方法
2.1 供试材料
供试精油：肉桂精油，百里香精油，丁香精油均购于吉安盛大香料油有限公司，密封避光4℃冰箱贮藏。
香菇：购自雅安市雨城区蔬菜批发市场，当天运回实验室进行分拣，选取菌盖呈茶褐色、菌褶纯白色、个体大小一致、无病虫害、无损伤的香菇进行保鲜试验。实验处理后装入18cm×20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，4℃冰箱贮藏。 2.2 试剂与仪器 2.2.1 主要试剂
所用试剂除注明外，均为分析纯，水为蒸馏水或超纯水，洗涤用水为城市饮用自来水。磷酸钠、邻苯二酚、过氧化氢、愈创木酚和焦亚硫酸钠均为分析纯，成都科龙化工试剂厂生产。 2.2.2 主要仪器
ULT 138.3.v型超低温冰箱 BS210S型电子天平(1/10000) UV-3200型紫外可见分光光度计 冷冻高速离心机 2.3 实验方法 2.3.1 样品处理
预处理：当天运回实验室进行分拣，选取菌盖呈茶褐色、菌褶纯白色、个体大小一致、
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海尔公司
塞多利斯北京天平有限公司 上海美谱达仪器有限公司 Thermo公司
无病虫害、无损伤的香菇进行保鲜试验。实验处理后装入18cm×20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，4℃冰箱贮藏。
经预试，各精油设置10μL/L、15μL/L、20μL/L、25μL/L 4个处理组，于室温（20～25℃）下熏蒸处理。将香菇装入一定体积的密闭容器内，在密闭容器内放一培养皿，将11cm×11cm的滤纸片固定在培养皿上，用移液枪将精油涂加在滤纸片上，精油不与菇体接触，立即密闭熏蒸。熏蒸3h后，将香菇取出装入18cm×20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，封口保湿。处理后的香菇放置于4℃的环境中贮藏，每组250g。同时设置两组对照，一组以未加精油熏蒸的香菇作为对照CK1。另一组先用0.01%焦亚硫酸钠水漂洗香菇3～5min，再用0.1%焦亚硫酸钠浸泡30min，取出菇体，自然晾干装入保鲜袋中，作为对照CK2。每药剂浓度处理重复3次。贮藏期间每隔3d取一次样并进行氧化生理指标的测定。 2.3.2 色泽变化与腐烂指数的测定
每天观察记载菇体表面色泽变化，新鲜菇体呈灰褐色(0)，随后逐渐加深至棕褐色(+)，最后变为黑褐色(++)。
按菇体腐烂面积的大小分为3级。0级无腐烂；1级腐烂面积小于50%；2级腐烂面积达50%以上；按下式计算腐烂指数：
腐烂指数=(腐烂级别×该级别菇体个数)/(菇体总个数×最高级别) 2.3.3 多酚氧化酶(PPO)活性的测定：
参考汤章城方法、《现代植物生理学实验指南》[33] 测定，略有改动。准确称取2.0g待测样品，并向其中准确加入17mL 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)制成粗酶液。取2.5ml 0.05mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液与5.0ml 0.2mol/L邻苯二酚混合。25℃保温10min后快速加入50μl酶液，立即计时，以蒸馏水为参比，在反应15s后开始记录420nm波长下的初始OD值，以后每间隔5s记录一次，连续测定OD值在3min内的增加量，计算酶活力。每个处理至少重复三次。以每g样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO酶活力单位（U），单位为△OD420/(min.gFW)。 2.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
参照《植物生理学实验技术》[34]的方法，略有改动。准确称取5.0g待测样品，并向其中准确加入5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)冷冻离心制成粗酶液。在指形试管中加入0.1ml酶液、2.9ml0.02mol/L H2O2溶液，以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在240nm波长的OD240值，作为初始值，以后每间隔10s记录一次，连续测定OD值在1min内的增加量，重复3次。以每g样品每分钟吸光度变化值减少0.01时为一个CAT酶活力
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单位（U），单位为0.01△OD240/(min.gFW)。 2.3.5 过氧化物酶(POD)活性的测定
愈创木酚法，参照《现代植物生理学实验指南》[33]，略有改动。准确称取2.0g 待测样品，并向其中准确加入17mL 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)制成粗酶液。在试管中加入2.6ml 2.5%愈创木酚和0.1ml 0.6% H2O2摇匀后置于30℃水浴5min，快速加入0.3ml酶液并开始计时，迅速倒入比色皿中，以蒸馏水为参比，记录反应体系在470nm波长的OD470值，作为初始值，以后每间隔5s记录一次，连续测定OD值在3min内的增加量，重复测定3次。以每g样品每分钟吸光度变化值增加1时为一个POD酶活力单位（U）。
3 结果与分析
3.1 不同浓度的三种精油对香菇颜色和品质的影响
表1 各精油处理下香菇的色泽和腐烂指数
Table.1 Lentinus edodes color and index of rotted against essential oils
保鲜剂及 浓度(μl/L) 变色 色泽 15d 18d 腐烂指数 15d 18d CK1 CK2 0 7 ++ ++ 0.2 0.38 0.1% 9 ++ ++ 0.32 0.66 10 12 ++ ++ 肉桂精油 15 15 + + 20 15 + + 25 9 ++ ++ 10 15 + + 0.2 百里香精油 15 13 + ++ 20 14 + ++ 25 12 ++ ++ 0.2 10 15 + + 0.3 丁香精油 15 12 + ++ 0.2 0.33 20 9 ++ ++ 0.5 25 9 ++ ++ 0.44 0.17 0.13 0.08 0.23 0.14 0.15 0.15 0.28 0.29 0.27 0.42 0.15 0.21 0.17 0.33 0.21 0.23 +表示棕褐色 ++表示黑褐色
在上表中，由腐烂指数和色泽变化可以看出，在贮藏后期，肉桂10μl/L、15μl/L、20μl/L都有防腐效果，但10μl/L的护色效果欠佳，香菇变色较为严重，20μl/L的防腐和护色效果突出；百里香精油的护色防腐效果整体都较好；10μl/L和15μl/L的丁香精油防腐效果相差不大，但20μl/L、25μl/L的丁香精油护色能力弱，腐烂指数也较高；高浓度的肉桂和丁香精油在后期腐败情况比对照组CK1明显。总的来看，三种精油中有较好保鲜效果的有20μl/L的肉桂精油、10μl/L、20μl/L的百里香精油和10μl/L的丁香精油。可初步推断精油对香菇有一定的毒害，毒害程度丁香精油>肉桂精油>百里香精油，这与前言中论述一致[31]。 3.2 不同浓度的三种精油对香菇PPO活性的影响
香菇在贮藏期间PPO活性的变化情况如下图1所示。可知，肉桂精油中，10μl/L、20μl/L两组在储藏的整个周期内均能有效抑制PPO活性，且效果优于对照组CK2；而25μl/L的精油第一个活性高峰在第12d，比空白对照组推迟了6天；15μl/L组在第12d出现第二个活性高峰，比空白对照组提前3天，且高于空白对照组，在贮藏后期15μl/L的肉桂精油对
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