2015届 分类号：O622.5 单位代码：10452
毕业论文
多肽的固相合成及固相反应在多肽合成中的应用
姓 名 薛立英 学 号 201110830203 年 级 2011级 专 业 制药工程 系 （院） 药学院 指导教师 李振 李冀伟
2015年4月10日
摘 要
为研究多肽的固相合成工艺，并为工业化合成目标多肽提供理论依据。本实验采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-Trt树脂作为固相载体，以FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH和FMOC-L-PRO-OH为原料合成目标产物五肽，将反应时间和反应温度作为控制反应的条件。实验得出最适合的合成条件为，0℃投入反应，在室温下分别搅拌5 h，过夜；目标产物五肽的最终纯度可达100.0%。该合成方法操作简便、产率高，可用于工业化合成多肽。
关键词：2-Cl-Trt树脂；固相载体；FMOC-L-LYS(Boc)-OH；FMOC-L-ALA-OH；有机合成；FMOC-L-PRO-OH
ABSTRACT
To study the artwork of solid phase synthesis of polypeptide,and to provide the theoretical basis for industrialization synthesis of objective polypeptide.Using Fmoc solid phase synthesis
method,with
2-Cl-Trt
resin
as
solid
phase
carrier,and
with
FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH and FMOC-L-PRO-OH as raw material to synthesis of target products.The orthogonal experiments were put forward by discussing and comparing some reaction conditions such as time and temperature.Results:Optimal conditions:0℃in reaction,respectively mixing five hours,at room temperature for the night.This method is easy to operate and has high product rate,can be applied on the large scale.
Key words: 2-Cl-Trt resin;solid phase carrier;FMOC-L-LYS(Boc)-OH;organic synthesis;FMOC-L-ALA-OH;FMOC-L-PRO-OH
药学院2015届本科毕业论文
目 录
1 引言 ........................................................ 1 2 实验部分 .................................................... 2 2.1 主要试剂、仪器和其他物品 ................................. 2 2.1.1 实验试剂 ............................................. 2 2.1.2 实验仪器 ............................................. 3 2.1.3 其他物品 ............................................. 3 2.2树脂的选择 ............................................... 3 2.3 合成方法 ................................................. 3 2.3.1 总反应方程式 .......................................... 3 2.3.2 以 FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料 ...................... 4 2.3.3 以FMOC-L-ALA-OH为原料 ................................ 4 2.3.4 以FMOC-L-PRO-OH为原料 ................................ 4 2.3.5 树脂的切割............................................ 5 2.4 LC-MS检测分析 ........................................... 5 3 结果与讨论 .................................................. 5 3.1 图谱分析 ................................................. 5 3.2 讨论 .................................................... 12 4 结语 ....................................................... 12 参考文献 ..................................................... 13 谢辞 ......................................................... 14
药学院2015届本科毕业论文
1 引言
多肽是一种涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物。到目前为止，人们已经发现和分离出存在于人体的肽大约有一百多种，对于多肽的研究和利用，已到了史无前例的高度。多肽的合成主要是指化学合成法，其中最主要的合成方法是液相合成和固相合成。现在，化学合成多肽的技术无论是固相法还是液相法都已经成熟。而且近年来，固相法合成多肽凭借其节省时间、物力、原料，易于用计算机分析，易于推广普及等显著优势而成为合成多肽的常用方法并扩展到其它有机物合成的领域
。
多肽固相合成法[1]—英文解释：solid phase peptide synthesis 简写为SPPS。多肽合成研究已经有一百多年的历史了。此方法起于1902年，但到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，例如胰岛素、催产素等，同时在多肽合成方法以及选择合适的氨基酸保护基上面也取得了不少的成绩，这为后来的固相合成方法的出现与发展提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法并迅速成为合成多肽的首选方法。但在合成多肽的过程中，由于氨基酸的侧链功能团易带来一系列的的副反应和消旋化，所以一般需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。目前固相合成多肽主要用两种保护基[16]：Boc（叔丁氧羰基）保护基和Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护基。其中α-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护的称为Fmoc固相合成法。而且这两种方法在固相合成树脂，多肽缩合试剂以及合成环肽的氨基酸正交保护上均取得了丰硕的研究成果。
多肽合成其实就是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端（C端）向氨基端（N端）合成。过去的多肽合成都是在溶液中进行的，但自从成功发展了固相多肽合成方法以来，经过几十年不断的改进和完善，到现在固相合成法已经成为合成多肽和蛋白质的一个常用方法，它的许多方面是传统液相合成方法无法做到的。固相合成多肽的基本原理是[17]：以不溶性高分子树脂作为固相载体，首先在固相载体上以共价键连接一个含有被封闭基团保护的氨基的氨基酸，然后以三氟乙酸作为脱保护剂，脱掉氨基的保护基，这样在固相载体上就连接上了第一个氨基酸。将上了保护基的第二个氨基酸的羧基通过用过量的活化羧基组分活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体上的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操作，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后用三氟乙酸将合成好的多肽从树脂上切割下来。
1
药学院2015届本科毕业论文
与液相合成多肽的方法相比，固相合成法合成多肽所具有的显著优点是[7~10]：操作简单，大大简化了后处理操作的步骤；由于反应在单口烧瓶等玻璃容器中便可进行，便于控制反应条件，还可避免因物质的多次转移而造成的损失；使用的反应物需过量，使反应完全，减少副产物，使得目标产物得到高产率和高纯度；与固相载体以共价键相连的肽链比较稳定，可以通过抽滤、洗涤来完成中间产物的纯化，可以避免液相法合成多肽中复杂的步骤，避免分离纯化中间产物时而造成的损失；增加溶剂化效率，减少中间产物的损失；能防止肽的重叠。
虽然采用固相法合成多肽已经有40多年的历史了，然而到现在，固相合成多肽仍然存在的许多的局限性[3~6]：固相合成法直接合成的多肽序列短，合成所需时间过长，合成的效率低，使用的试剂毒性较大，产生的副产物不易分离，氨基酸易消旋化，而且合成所需成本过高，所以无法合成肽链较长、相对分子质量较大的蛋白质类物质；由于固相载体上中间合成产生的杂肽无法被分离掉，这样就造成最终产物的纯度有时不如液相合成物的，因此需要通过可靠的分离手段进行纯化。
现在，多肽固相合成法在生物制药工程及蛋白质工程中均有着广阔的发展应用前景。多肽固相合成法在免疫学研究领域、药物研究领域、蛋白质结构研究领域等都呈现着显著的优越性。由于在治疗某些比较棘手的疾病方面，多肽类药物所具有的独特治疗效果，使得越来越多的化学家和医学家来关注和研究，并取得了显著的研究成果。而且现今社会，随着合成技术的不断发展和成熟，合成仪器的不断改进和完善，可以合成蛋白质的范围将不断扩大，合成时间将会显著缩短，合成成本也将会越来越低；同时通过多肽固相合成法，还可以引进稀有氨基酸，从而对新的蛋白质的结构与功能进行研究和探索。
本论文就是采用Fmoc合成法合成多肽，研究了固相合成多肽的实验过程，优化了合成步骤，并对实验结果进行了分析讨论。
2 实验部分
2.1 主要试剂、仪器和其他物品
2.1.1 实验试剂
2-Cl-Trt树脂（美国Aldrich公司）；FMOC-L-LYS(Boc)-OH[9-芴甲氧羰基（叔丁氧羰基）左旋赖氨酸，美国Aldrich公司]；FMOC-L-ALA-OH（9-芴甲氧羰基左旋丙氨酸，美国Aldrich公司）；FMOC-L-PRO-OH（9-芴甲氧羰基左旋脯氨酸，美国Aldrich公司）；MeOH（甲醇，上海巴斯夫）；DMF（N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫）；20%哌啶-DMF（20%哌啶-N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫）；DCM（二氯甲烷，中国医药集团上海化学试剂公司）；HCTU（6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷
2