答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base Molecular Weight A C G T I U 313.21 289.18 329.21 304.19 314.2 290.17 常规修饰基团分子量
5’-Biotin 5’-(6 FAM) 5’-HEX 5’-TET 5’-Cy5 5’-Cy3 405.45 537.46 744.13 675.24 533.63 507.59 3’-TAMARA 3’-Dabsyl 3’-(6 FAM) 3’-Amino Modifier C3 3’-Amino Modifier C7 3’-Thiol Modifier C3 623.60 498.49 569.46 153.07 209.18 154.12 12.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管 底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引 物在这种条件下不稳定。
13.如何保存引物？
答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
14.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。
15.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
16.测序发现引物有突变是怎么回事？
答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制 办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主 要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变 往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一 般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继 续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对， 当扩增的产品被亚克隆转 化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和
扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段 如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。
引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。
17.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都 有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物 中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都 要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18.如果测序发现突变，该如何处理？
答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的 原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正 确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突 变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因 为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
19.如果测序发现引物突变，是否有补偿？
答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。
20.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量 都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现 象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
21.为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高？
答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了，还有那30%是什么？ 引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰 引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱 峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。
22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。
23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？ 答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物◆长度一般为◆G-C
50-150bp），但不能与引物重叠。
18-40mer 。
含量控制在40-80%左右。
GGGG或更多G出现。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免◆在引物的
5’端避免使用G。
C。
◆选用比较多的碱基◆退火温度
Tm控制在 68-70C左右。
有用的荧光染料参数
Name 6-FAM 吸收波长 发射波长 Name colors 6-carboxy-fluorescein 494nm 521nm 535nm 560nm 518nm 538nm 553nm 582nm Green Orange TET 5-tetrachloro-fluorescein HEX 5-hexachloro-fluorescein Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 552nm 643nm 607nm 570nm 667nm Red Cy3 Indodicarbocyanine Red Cy5 Indodicarbocyanine Violet 24.Primer设计的基本原则是什么？ 答：引物设计的下列原则供您参考。 ◆引物长度一般在18-35mer。 ◆G-C含量控制在40-60%左右。 ◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 ◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
25.用软件设计的引物为什么不管用？
答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导 意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应 模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没 有太多的选择的。
26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280 的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions