抗血管生成治疗在肝癌介入治疗中的作用
肝癌是常见的富血管性肿瘤，在我国发病率和死亡率均极高，严重危害人们的健康。目前在我国很大一部分肝癌在就诊时因肿瘤体积大，不能外科手术，经肝动脉化学性栓塞（TACE）是其首选的治疗方法[1，2]，但TACE的疗效并不令人满意。影响TACE的疗效的因素很多，其中TACE后肿瘤的侧枝血管形成是重要因素之一，栓塞术后肿瘤的侧枝血管形成越快、越多，介入治疗的难度就越大，肿瘤易复发和转移，预后差[3，4]。TACE后肿瘤的侧枝血管形成是肿瘤血管生成的结果。现就肿瘤血管形成的机理、抗血管生成抑制剂的研究现状、肝癌TAE术与血管生成的关系及其治疗对策作一综述。 1、肿瘤的生长与血管生成：
血管生成(angiogenesis)是从已存在的微血管上芽生出新的毛细血管过程。实体肿瘤生长经历了两个时期：在肿瘤直径小于2～3mm的时候，肿瘤无需新生血管，肿瘤细胞是通过组织间液获取从毛细血管渗透的营养物质，排泄代谢产物，并进行氧气交换，此时称为血管前期[5，6]。在此期促血管生成因子(angiogenesis activators)和血管生成抑制因子(angiogenesis inhibitors)处于动态的平衡。随着肿瘤细胞的进一步增殖，肿瘤出现缺氧、PH值升高、NO升高等微环境的变化[5]，刺激肿瘤细胞和宿主细胞产生促血管生成因子，并下调血管生成抑制因子，打破了二者在肿瘤局部组织的平衡，从而启动了血管生成。当肿瘤有血管生成时，肿瘤可呈指速加速增大，并且获得转移能力，称血管期[7，8]。肿瘤血管生成有多种因子参与，其过程为[5-10]：①肿瘤组织在缺血缺氧等因素的作用下产生一些可溶性的促血管生成因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等。②毛细血管内皮层下基底膜降解和血管周围细胞外基质的重塑。在此期原有的血管充血，通透性增高，细胞连接松弛，基底膜被多种消化酶消化而溶解断裂，形成间隙。此过程有多种水解酶参与，如肝素酶、组织蛋白酶B、D，纤溶酶，纤溶酶原激活剂，弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶等。③内皮细胞迁移和增殖。此期内皮细胞大量增殖，穿过原有血管的细胞间隙到达血管周围组织，形成管状由内皮细胞构成的血管芽。④新生血管形成。新形成的血管芽吻合成襻，周皮细胞和成纤维细胞合成基底膜，覆盖血管芽。新形成的小血管逐渐分化成小动脉和小静脉，与原有的血管形成完整的血管网。在血管期除肿瘤细胞分泌的生长因子刺激自身生长以外，新生的血管能通过旁分泌作用使血管内皮细胞产生生长因子刺激肿瘤细胞生长，使肿瘤长至临床可见的地步。同时由于血管基底膜破坏，肿瘤细胞容易进入血管内形成远处转移。 2、肿瘤的转移与血管生成：
肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤的过程，一般分为[11]：①肿瘤细胞从原发灶脱落；②降解细胞外基质及血管基底膜，迁徙、浸润并粘附于血管内皮细胞；③进入循环系统，随血液流至远处血管壁；④透过血管壁，侵入细胞外基质，形成转移灶。上述各步骤几乎都与血管生成的过程有关，表现在以下几个方面：①肿瘤血管增多为转移提供了条件；②在血管生成过程中，细胞外基质的降解、血管基底膜的通透性增加、血管内皮间隙增大等均对肿瘤细胞的脱落、迁徙、侵入血管有利[12]；③转移灶的生长亦有赖于血管生成。 3、与肿瘤血管生成有关的主要因子及作用：
参于肿瘤血管生成的因子很多，有些是促进血管生成，有些是抑制血管生成，还有些因子起调控作用。现将几种主要的与肿瘤血管生成有关的因子介绍如下：
3.1 促肿瘤血管生成的因子:
3.1.1血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)：是一个分子量为34~45KD的高度糖基化的碱性蛋白，由分子量为17~22KD的同源双聚体构成[13]。它是血小板源生长因子(PDGF)家族的一个成员，与PDGF具有21%~24%的同源性。人的VEGF基因由8个外显子组成，定位于染色体6p21.3上[14]，其mRNA经不同的剪接方式形成4种不同分子量大小的分子，即VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206[15]。这四种形式的VEGF均能诱导内皮细胞增生，但由于它们与存在于细胞表面和细胞外基质中的乙酰肝素蛋白聚糖的亲和力不同，使他们在定位上有很大的差别[16]。VEGF189和VEGF206对乙酰肝素有很高的亲和力，它们大部分与细胞和细胞外基质结合，属于不溶性蛋白； VEGF165与乙酰肝素的结合力较低， VEGF121则完全不与乙酰肝素结合，故这二者为可溶性蛋白，除VEGF165少部分与细胞和细胞外基质相结合外，这二者可以释放到细胞外，以旁分泌的形式作用于周围的内皮细胞。VEGF是通过内皮细胞表面的受体VEGFR（包括KDR/FLK1和FLT1）发挥作用的[17，18]，它的表达是受缺氧高度调节的。VEGF是目前公认主要促进血管发生蛋白之一。其作用包括[19]：①刺激体外培养的内皮细胞的增殖（有丝分裂），迁移和体内血管生成；②促进血管通透性增加，利于肿瘤血道转移；③抑制抗原提呈细胞如树突细胞的成熟，从而促进肿瘤的免疫逃避；④促进凋亡抑制基因bcl-2表达，抑制肿瘤的凋亡。
3.1.2 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）：是由146个氨基酸组成的分子量为18kD的多肽生长因子，人体内还存在22~24kD的同种异构体，位于4号染色体上[20]，是中胚层和神经外胚层细胞的促有丝分裂和血管生成的重要因子，在体内分布广泛，具有增加内皮细胞的化学趋向性、促进血管内皮细胞的分裂、毛细血管出芽生长、诱导蛋白溶解酶生成和有利于内皮细胞穿透基质的功能[21]。
3.1.3 血小板源生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）由分子量为16~18kD和14~16kD的两个亚基组成（A、B链），因来源不同，有三种异构体，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGF-AB。血小板、平滑肌细胞、内皮细胞和单核巨噬细胞均能分泌PDGF或PDGF样物质[22]。PDGF具有促分裂活性和趋化活性，是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激内皮细胞的增生、迁移和分化，并可以促进细胞基质的增生与合成，实验证明PDGF可使肿瘤血管密度增加。其作用机制是其与细胞表面的受体结合，激活磷脂酶C，后者水解二磷酸肌醇生成1,4,5-三磷酸肌醇和甘油三酯，使胞内钙离子浓度增加，促进一系列原癌基因如C-sis的表达，促进细胞的DNA合成和有丝分裂[23]。 3.1.4 血管生成素（angiogenin）：是一种分子量为14.1kD的碱性单链多肽，含123个氨基酸，属于核糖核酸酶超家族的一员[24]。它由肝脏产生，具有RNA酶A (RNAase A)的催化活性中心，可以水解RNA，但其活性只有RNAase A的10-5～10-6[25]。血管生成素具有强烈的血管生成活性，其作用机制并不十分清楚，研究发现其可与细胞表面的受体结合，激活磷脂酶C和A2，继而激活第二信使，产生一序列效应[26、27]；它还可以以内吞的形式进入细胞内，到达细胞核内发生作用[28]。它可以增强内皮细胞的增殖，细胞外的血管生成素已被证实为粘附分子，可以促进细胞粘附和迁移[29]。
3.1.5 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP） MMP家族包括胶原酶、明胶酶、间质溶素、膜型基质金属蛋白酶等，是细胞外基质（extracellular
matrix, ECM）降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。肿瘤组织与间质细胞中纤维母细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等均可表达MMP，但以肿瘤组织表达相对较高[30]。组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)是MMP的天然抑制剂，TIMP与MMP之间平衡关系在调节ECM的稳态中有重要作用[31，32]。MMP的作用[33]：①参与肿瘤血管生成过程中毛细血管内皮基底膜的降解和ECM的降解。在血管形成过程中，血管内皮细胞与肿瘤均能分泌蛋白水解酶降解ECM。如Ⅳ型胶原酶(MMP-2、MMP-9)参与基底膜降解的过程；间质胶原酶(MMP-1)、多形核胶原酶(MMP-8)能降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)在内皮细胞表面的表达则促使局部胶原和层粘蛋白降解。VEGF、bFGF等细胞因子能上调内皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activactor, uPA)的表达，uPA能激活纤溶酶，并进而激活MMP。②在肿瘤的侵袭和转移过程中起重要作用。肿瘤侵袭和转移过程是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围和/或远处组织侵袭和转移的过程，涉及肿瘤细胞穿过ECM屏障、血管壁的基底膜及穿出血管壁进入宿主微环境的过程。MMP在降解ECM和基底膜的过程中发挥重要的作用。
3.1.6 细胞粘附分子：在血管生成过程中，内皮细胞的启动、增殖和成熟过程必须相互粘附，并与细胞外基质粘附，粘附分子在其中发挥重要作用。数种整合素表达于内皮细胞表面，参与内皮细胞的迁移与血管生成，如已证实整合素ανβ3在血管生成中的重要作用[34]，E-选择素也参与血管生成。
3.1.7 其他：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可通过促进内皮细胞分化、管样结构形成和基质产生来刺激血管生成，或通过间接途径刺激其他细胞产生血管生成因子。转化生长因子-β（TGF-β）由巨噬细胞和活化的血小板产生，它可以促进已停止增殖的内皮细胞分化，并可以促进基质的合成，缺乏时血管的完整性不良和再塑性降低。此外，表皮生长因子（EGF）、集落刺激因子G-CSF和GM-CSF均可以刺激血管生成。
3.2 抑制肿瘤血管生成的因子
3.2.1血管抑素(angiostatin) 和内皮抑素（endostatin）：此为两种来源于肿瘤组织的血管生成抑制剂。血管抑素是O'Reilly等[35]于1994年从Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离得到分子量为38kD的蛋白。氨基酸序列分析提示血管抑素与纤溶酶原N末端98位氨基酸残基到440位氨基酸残基的内片段有98%的同源性。纤溶酶原有5个三环结构，称作Kringle区，血管抑素则具有前4个KringIe区和部分的Kring1e5区，依靠3个二硫键连接。它是由肿瘤产生或活化某些蛋白酶，使纤溶酶原分解而成[36]。内皮抑素是O'Reilly等[37]于1997年以相同的方法从患内皮细胞瘤的小鼠血清中分离得到的另一个来源于肿瘤的内源性血管生成抑制剂，分子量约20kD，抗肿瘤血管形成作用更强。它是胶原蛋白ⅣC末端的一个非胶原区片段，由组织蛋白酶L和金属蛋白酶通过水解Ⅳ型胶原C末端而产生[38]。血管抑素和内皮抑素能特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移，抑制肿瘤的生长和转移。动物试验表明可以明显抑制裸鼠体内鼠肺小细胞癌、人乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胶质瘤等的生长，并可以和放、化疗合用[39-41]。 3.2.2血小板因子-4 (platelet factor-4)：是一种天然存在于血小板α颗粒中的化合物，能抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。其作用机理为[42-43]：①阻止bFGF二聚体化而抑制其活性；②阻断bFGF与其受体结合；③抑制内皮细胞表达金属蛋白酶MMP-l和MMP-3，而不影响TIMP-l和TIMP-2，从而抑制基底膜降解；
④削弱p2l(Cipl/WAF1)的下凋，而抑制周期蛋白E-cdk2活性，使细胞进入S期受阻。血小板因子-4已被应用于Kaposi肉瘤、脑肿瘤及其他实体瘤的临床试验，该药在血中仅能维持几分钟，能被较好地接受，有轻微的毒性，表现为注射处的局部反应，轻微的静脉炎、疲劳和贫血等。 3.2.3血小板反应素（thrombospondin, TSP）
TSP是一种糖蛋白，可由内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等多种细胞分泌，可调控内皮细胞的粘附、运动以及蛋白水解酶的活性，并可与血管形成的诱导因子螯合，从而抑制血管形成。部分抑癌基因，如野生型p53，可通过上调TSP抑制肿瘤血管形成。TSP的抗肿瘤血管形成作用的具体作用机制尚不清楚，推测与下调VEGF有关[44-46]。
3.3 参于肿瘤血管生成调控的因子
3.3.1缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor, HIF-1）：是一个包括120kD的α亚单位（HIF-1α）和91-94 kD的β亚单位（HIF-1β）的二聚体，两部分均与DNA紧密结合而发挥作用。在细胞内，HIF-1β通常保持在较高的水平，而HIF-1α的浓度随缺氧或低糖的程度而变化，在明显缺氧或低糖的环境下HIF-1α mRNA水平并没有显著增高，而是HIF-1α的稳定性提高在细胞内积聚，当缺氧或低糖改善时，HIF-1α被迅速降解。HIF-1调控的靶基因均与O2或能量代谢有关，这些基因包括EPO、VEGF、内皮素-1、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、醛缩酶、烯醇化酶、乳酸脱氢酶A、糖原转运酶等。HIF-1在基因水平上直接调控VEGF的表达[47]，在VEGF 5’端有长达2274个碱基序列受HIF-1调控，HIF-1与相应的DNA结合，进而激活了的HIF-1α羧基端转录活性区域，激活的HIF-1α与核磷酸蛋白P300/CBP-CH1结合，将转录信号传给VEGF或其它与氧代谢有关的基因，发挥其转录活性[48]。
3.3.2 肿瘤相关基因：肿瘤相关基因的异常表达能导致旁分泌的血管调节因子表达水平改变，参与肿瘤血管生成的调节。ras基因突变后以非自分泌的、细胞种类依赖的方式诱导VEGF的表达，K-ras基因突变可促进肿瘤血管生成[49，50]。P53是一种参与细胞周期和凋亡调节的核蛋白，此基因已在肿瘤组织中突变，导致HIF-1α增加和VEGF转录增强[51]，从而使肿瘤在缺氧状态下存活，上调VEGF表达和下调血栓反因素表达，使肿瘤血管生成处于优势状态。 4、抗肿瘤血管生成的治疗 近年来，随着人们对肿瘤的微血管研究的深入，发现肿瘤组织周围的微血管生成进程、微血管性质和密度直接关系到肿瘤的生长、侵袭和转移。抗血管生成治疗（antiangiogenesis）已经成为人们研究的热点，它是通过抑制和预防肿瘤的血管生成，达到控制肿瘤生长的目的[52，53]。其作用环节是：①干扰、抑制血管生成因子的合成与释放；②干扰血管生成因子在细胞间传递；③抑制细胞外基质的分解；④抑制内皮细胞的增殖；⑤抑制内皮细胞的迁移。目前抗血管生成治疗的方法大致分为药物治疗和基因治疗两大类。 4.1 药物治疗
目前研究的抗血管生成的制剂很多，上述抑制血管生成因子目前已试验用于肿瘤的治疗，如血小板因子-4已试用于临床，angiostatin和endostatin用于动物实验取得很好的疗效。现就其他正在进行临床试验的制剂作一介绍：
4.1.1干扰素(interferon, IFN)：包括白细胞来源的IFN-α、成纤维细胞来源的IFN-β和免疫细胞产生的IFN-γ。研究表明IFN-α与IFN-β有抑制新生血管形成的作用[54-58]，①IFN有抗增殖活性：体外培养的内皮细胞中已被证明IFN-α
可直接抑制人表皮微血管内皮细胞和人毛细血管内皮细胞的增殖，其机理可能与IFN延长所有类型细胞的细胞周期时相，并减少一些必要的代谢物有关。②IFN-α和IFN-β可以抗血管内皮细胞和肿瘤细胞迁移，如在近伤口皮下注射IFN-α和IFN-β，可抑制毛细血管内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞等的增殖、迁移和浸润，使伤口的愈合延迟。③IFN-α和IFN-β可以下调人肿瘤bFGF的转录和翻译及Ⅳ型胶原酶的表达。④IFN还可能通过降低内皮细胞表达整合素ανβ3、MMP-2或干扰素诱导蛋白l0(interferon-inducible protein 10, IP-10)而参与对肿瘤新生血管的抑制作用。目前IFN-α应用于婴儿血管瘤、肺多发性血管瘤病、血管外皮细胞瘤、Kaposi血管内皮细胞瘤、表皮的血管内皮细胞瘤、Kaposi肉瘤、肾癌和黑色素瘤等取得了较好的疗效[59，60]。 4.1.2白介素-12（interleukin-12, IL-12）：是一种细胞因子和免疫调节物，它对肿瘤有直接对抗作用。动物试验表明，IL-12有抗肿瘤和抗转移的能力。IL-12亦表现出抗血管生成作用，其机理为[61，62]：①IL-12可以上调肿瘤细胞IFN-γ的表达，间接诱导干扰素诱导蛋白IP-10的释放剂抑制bFGF产生，抑制肿瘤细胞或血管生长因子诱导的血管形成。②IL-12能够活化T淋巴细胞及NK细胞，发挥细胞毒作用而抑制肿瘤的生长和转移。40位肿瘤患者(包括肾癌、黑色素瘤、结肠癌等)接受重组人IL-12治疗，剂量由3ng/kg/d渐升至1000 ng/kg/d，静脉推注，15d为一个疗程，多数患者症状减轻，肿瘤进展减慢。常见毒性反应为寒战、发热、乏力、恶心、呕吐和头痛。剂量相关的毒性反应表现为转氨酶升高、肺毒性及白细胞减少等。最严重的毒性反应出现于第一次注射后，以后逐渐减弱[63]。
4.1.3 TNP-470：全称是O-（氯乙酰-氨甲酰基）烟曲霉醇，亦简称为AGM- 1470，是一种人工合成的烟曲霉素类似物，因其高效而低毒，现已成为颇受人们关注的血管生成抑制物之一[64]。TNP-470具有强有力的抑制内皮细胞生长作用，它通过活化内皮细胞p53而导致G1期细胞周期依赖激酶抑制剂p21的积聚，使内皮细胞停滞在G1期[65]。TNP-470现已用于乳腺癌、结肠癌、肾癌、黑色素瘤、神经系统肿瘤等多种恶性肿瘤的临床试验中，肿瘤的生长不同程度地受到控制[66-68]。TNP-470半衰期短，血中仅能维持数分钟，常见的用药方法为：静脉滴注1小时，每日或隔日1次，最大耐量60mg/m2，或静脉滴注4小时，每周1次，最大耐量177 mg/m2。TNP-470常见的副反应为乏力、恶心及神经系统症状。
4.1.4反应停(thalidomide)：曾作为镇静催眠药1953年在西德首先合成，后来因有明显的致畸作用而一度弃用[69]。近年来动物实验及体外实验均发现反应停具有抗血管生成的能力，机理目前尚不清楚，可能机理为[70-72]：①抑制bFGF的表达；②抑制VEGF诱导的caveolin下调，后者可能作为VEGF受体信号传导的负调节者发挥作用；③抑制TNF-α的合成，进而减少IL-6产生，抑制肿瘤生长；④抑制整合素表达。反应停Ⅱ期临床试验用于治疗Kaposi肉瘤、乳腺癌、前列腺癌及原发脑肿瘤，现已进入Ⅲ期临床试验。初步结果表明，反应停在较大的剂量范围内耐受性较好，主要的副作用为镇静和致畸[73，74]。
4.3.5基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)：人工合成和天然的TIMP能阻断基质金属蛋白酶(MMP)降解细胞外基质成分，从而抑制肿瘤的转移和新生血管的产生。BB94(batimastat)是一种人工合成的小分子基质金属蛋白酶抑制剂。在体外，它对MMP-2、MMP-3和MMP-9等多种MMP有抑制作用。BB94对MMP的抑制作用可能是通过结合MMP活性位点的Zn离子