对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
4. PCR循环次数过多： 当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后，反应中Taq DNA 聚合酶已经不足， 如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60 轮循环后，扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
5. 酶的质和量，催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
四．PCR扩增出现涂抹带
1、原因：往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
2、对策：
1） 减少酶量，或调换另一来源的酶； 2）减少dNTP的浓度； 3）适当降低Mg2+浓度； 4）增加模板量，减少循环次数。
五、标准问题
转基因成分检测一般按照标准方法进行，引物和PCR反应体系一般都经过了严格的循环验证。有时标准方法可能存在问题，导致假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的产生。标准方法可能存在的问题有：
1.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
2. Mg2+ 浓度不合理： Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。
3. 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 、 30ul 、 50ul 。或 100ul ，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
4.PCR温度设置不合理：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。
六、检测极限问题
当样品中转基因成分很低时，反应体系内可能不含有扩增模版，因而容易造成假阴性结果。PCR理论检测极限是在反应体系中存在一个拷贝的目标DNA分子，由于人的判读能力限制和PCR效率等原因，定性检测实际极限值一般是理论检测极限值的10-30倍。也就是说，如果转基因成分低到检测极限时，检测不到转基因成分的可能性会很大，或者说出现假阴性的概率很大。出现假阴性的原因是由于抽样误差，反应体系中不存在有效扩增的模版分子。此时是不适合做PCR检测的。
根据作物基因组的大小，可以计算出不同作物的理论检测极限并估计出实际检测极限。例如在100微升的反应体系中，小麦基因组有0.58万个拷贝，一个转基因拷贝的重量比（理论检测极限）是0.0174%，玉米的理论检测极限是0.003，其他作物的理论检测极限一般在0.001%-0.01%。如果反应体系是20微升，理论检测极限值将提高5倍，小麦为0.085%，玉米为0.015%， 其他作物将在0.005-0.05%之间。反应体系是20微升的定性检测实际极限值一般是在0.05-0.5%。低于这个含量时，反应体系中有时不含扩增模版DNA，因此很难得到正确的检测结果。
七． 怎样查找污染源
如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。环境污染中常见的污染源主要有：
1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源：1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去离子水浸泡；3）取5ml 做PCR 实验；4）电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
八．污染处理 （一）环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等）均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（ 0.13/碱基）在DNA 分子上随机分布，一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp 的片段，每条链上仅有6 处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染 可采用下列方法之一处理：
1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min 后加热灭活，然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；
2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR； 3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法；
4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA，2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。
3. dU 引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb 以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消
化掉。
（四） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。