２０２２
蔗糖梯度离心技术方法在提取内质网的应用
２２２付政祺１， 杨 莹 田 青
湖北省武汉市 ４１ 江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室，３００５６； ２ 华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系
摘要 目的：通过蔗糖梯度离心方法提取内质网，探讨在内质网提取过程中质量控制的关键要素。方法：本文利用蔗／糖建立连续的密度梯度，通过超速离心提取ＨＥ并利用Ｗ内质网特异性Ｋ２９３ｗｔ细胞中的内质网，ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术、 ／抗体Ｂ确定内质网所在层面，成功提取高浓度、高质量的内质网。结果：通过ｉＧＲＰ７８对内质网所处位置进行检测，ｐ／对ＨＥ经Ｗ内质网位于蔗糖梯度的第１Ｋ２９３ｗｔ细胞的破膜方法和离心时间进行调整，ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测，０、１１、１２ 层。结论：选择合适的破膜方法和离心时间是成功提取高浓度、高质量内质网的关键。关键词 内质网提取 梯度离心
（）中图分类号：Ｇ６３４．９１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１７５８５２０１１１７２０２２０３－－－ＭｅｔｈｏｄｏｆＥｘｔｒａｃｔｉｎＥｎｄｏｌａｓｍｉｃＲｅｔｉｃｕｌｕｍｂＳｕｃｒｏｓｅＧｒａｄｉｅｎｔｓＣｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ ｇｐｙｇ
，ＺｈｅｎｉＹＡＮＧＹｉｎＴＩＡＮｉｎ．ｅａｒｔｍｅｎｔｏＰａｔｈｏｌｏａｎｄ ＰａｔｈｏｈｓｉｏｌｏＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌｏＪｉａｎＦＵ ＊， ＊Ｄ ｐｆ ｇｙｐｙｇｙ，ｆ ｇ－ｇｑｇＱｇ
ｈａｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔＷｕｈａｎ ＣｉｔＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ４３００５６ ｙ，ｙ，
：ＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｋｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｓｅａｒａｔｉｎａｎｄｅｎｒｉｃｈｉｎｅｎｄｏｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ） ｐｙｐｇｇｐｊ ：／ｂｓｕｃｒｏｓｅｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＨＥＫ２９３ｗｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｈｏｍｏｅｎｉｚｅｄａｎｄｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｏｎａｎｅｕｉｌｉｂｒｉｕｍｒａｄｉｅｎｔｓ ｙｇｇｑｇ
（）ｓｕｃｒｏｓｅｂｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅｌｏｗｅｒ８ｆｒａｃｔｉｏｎｓｔｏｔａｌ１２ｆｒａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｆｌｏｔａｔｉｏｎｒａｄｉｅｎｔｒｅｃｉｉｔａｔｅｄ ｙｇｇｐｐ ／／（ｓｅａｒａｔｅｄｂ１０％ＳＤＳＰＡＧＥ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｕｓｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔＢｉＧＲＰ７８ｓｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄａｎｄ ｐｙｙｇｇｇｐｐｙ ：ｏｆＥＲ）．ＲｅｓｕｌｔｓＥＲｗａｓｆｏｕｎｄｍａｉｎｌｉｎｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆ１０，１１，ａｎｄ１２，ａｆｔｅｒａｄｕｓｔｍｅｎｔｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓｏｆｈｏｍｏｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｙｊｇ ：ａｎｄｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎｔｉｍｅｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｒｏｒｉａｔｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｈｏｍｏｅｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｉｍｅｏｆｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎａｒｅｔｈｅｋｅｔｏ ｇｐｐｐｇｇｙ ｓｅａｒａｔｅａｎｄｅｎｒｉｃｈＥＲ． ｐ
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，Ｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ ｐｇ使得不同大 借助离心机旋转所产生的离心力，
小、不同密度的物质进行分离的技术，称之为离心分
［１］
），离（它被广泛应用于细胞的收集、ｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎｇ
并需离。分离活细胞的介质除了要对细胞无毒外，能产生适当的密度梯度，且黏度不高、渗透压不大，以防止引起细胞和细胞器Ｈ中性或易调为中性，ｐ
影响细胞或细胞器的提取及其质量。的水肿或塌陷，１ 材料和方法１．１ 材料
１．１．１ 实验细胞。本实验所用细胞为野生型人胚胎肾细胞瘤细胞（ｗｉｌｄｔｅＨｕｍａｎＥｍｂｒｏｎｉｃ ｙｐｙ，／）由许华曦博士（Ｋｉｄｎｅ２９３ＨＥＫ２９３ｗｔＲｏｃｋｅｌｌｅｒｙ
［３］
，提供。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔＮＹ，ＵＳＡ）ｙ，，美国）１．１．２ 主要仪器。电动匀浆器（ＧｌａｓＣｏｌ－，，超声仪（美国）Ｓｏｎｉｃｓ＆ＭａｔｅｒｉａｌｓｉｎｃＴＰ２００振荡 －，低温高速离心机（日立）台式高速离心机（器，Ｓｉ－ｇ），，东方特力科贸中心）转膜仪ｍａＤＧＣ型电泳仪（－（，，北京市六一仪器厂）垂直型电泳槽和湿ＢｉｏＲａｄ－
，，式电转膜槽（Ｈ美国）恒温水浴箱（武汉科学ｏｅｆｅｒ，，仪器厂）武汉科学仪器厂）图４℃恒温振荡摇床（，，像分析系统（美国）ｒｏｌｕｓｋｏｄａｋＩｍａｅＨｉｍａｃ －ｐｐｇ，，）。ＣＳ１５０ＧＸ超速离心机（ＨｉｔａｃｈｉＴｏｋｏＪａａｎ ｙｐ／１．１．３ｉＧＲＰ７８购自Ａｂｃａｍ公司。 主要试剂。Ｂｐ羊抗兔过氧物酶结合二抗、羊抗鼠过氧物酶结合二，抗、增强化学发光（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ，显色液、过硫酸铵（ｅｒｓｕｌｆａｔｅＥＣＬ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐ
细胞碎片和沉淀的分离等。随着超速离心机的问离心技术不再被简单地用于较大颗粒的粗略分世，
细胞器的分离、纯化技术得以建立，使得对各细离，
胞器特有化学组成、功能的研究变成可能。本文主要针对超速离心提取内质网的方法及质量控制进行详细介绍。离心分离的基本方法，包括差速离心（）和密度梯度离心（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎｄｅｎｓｉ －ｇ
［２］
）。差速离心是指在密ｔｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ ｙｇｇ
度均一的介质中由低速到高速对大小不同的细胞和细胞器进行逐级离心。但由于各种细胞器在大小和密度上的相互重叠，以及某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，使得细胞器的分离需要重复多次。因此，差速离心主要用于细胞器的初筛或分离大小、密度悬殊较大的细胞。密度梯度离心是指用一定的介质（氯化铯、蔗糖等）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将不同密度细胞的混悬液或经匀浆破膜的细胞混悬液置于介质的顶部，通过足够大的离心力、足够长时间，使得不同密度的细胞或细胞器沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将其进行分层、分