本文将结合对FISH技术在不同染色体或DNA纤维切片上的分辨率水平的分析,阐述这项技术在构建高分辨率的分子图谱中的应用前景。
1在中期染色体上的荧光原位杂交
早期的荧光原位杂交技术多以中期染色体作为靶DNA的载体。,另一方面制片技术也比较容易掌握。许多人都曾成功地在中期染色体上用FISH。一个典型的例子是Lichter等(1990)选用了50个人类第11条染色体的,,排列出所有探针在染色体上的顺序。进一步,DNA序列之间的相对关系,,由于使用的中期染色体已是DNA,FISH技术就不能分辨1～3Mb(百万碱基对)之间。类似的结(Lawrence等,1990;Trask等,1992)。然而,对于克隆一个只有几kb长度的基因来说,1～3Mb的分辨率水平是远不够的。另外,中期染色体还有一个缺点,由于染色体高度浓缩,对于一些基因组较小的种类,如酵母、Arabidopsis、番茄、水稻等,在光学显微镜下很难根据每条染色体的结构分辨出单条染色体,这也给构建图谱带来困难。
要提高FISH技术的分辨率水平,人们很容易想到使用浓缩度低的染色体作为靶DNA的载体。有人考虑到使用有丝分裂前期染色体(mitoticprophasechromosomes),Inazawa等(1994)报道通过同步化处理,可从人的淋巴细胞中得到拉长的前期染色体。在一个360kb的DNA分子区域内,用两色FISH技术在这种前期染色体上能够准确地观察到两个相距175kb的探针被分离开。但这种染色体切片不容易制备,而所能提高分辨率的能力有限,因此,用这种染色体切片进行荧光原位杂交的报道并不多见。Haaf和Ward(1994
)发展了一项技术,可用离心机械力将中期染色体拉长5～20倍。在这种拉长的中期染色体上进行荧光原位杂交,可将分辨率水平提高到200kb左右。但利用这种受机械力拉长的中期染色体,其染色体结构可能会受到一定程度的破坏,并且不同区域的染色体拉长的程度也可能不同,会给图谱的准确性带来人为的干扰。
2在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交
在分析了有丝分裂和减数分裂所有时期染色体的结构特征和进行高分辨率FISH的可能性之后,我们发现减数分裂粗线期(pachytene)是最理想的时期(Zhong等,1996a和Zhong等,1996b)。这一时期的染色体已经完成了同源染色体的配对,利用特殊的制片技术,可以分离到单条染色体,其长度通常比相应的中期染色体长10～20倍。而这一时期染色体的形态也十分特殊,着丝点(centromere)和端粒(telomere)结构很容易识别,并且每条染色体的异染色质(heterochromatin)和同染色质(euchromatin)区都有可识别的结构特征。以番茄为例,Ramanna和Prakken早在1967年就建立了一套根据粗线期着丝点的位置、短臂和长臂的比例以及异染色质和同染色质的结构特征来识别12条番茄染色体的方法。不久前,我们发展了一种从番茄花药的花粉母细胞中制备粗线期染色体的技术,能够分离到不带细胞质的单条粗线期染色体,并能根据Ramanna的方法识别出每条染色体,用番茄染色体的端粒重复序列(telomericrepeat)和端粒联接重复序列(telomere-associatedrepeat)作为探针,在这种染色体上进行两色荧光原位杂交,证实其分辨率能够达到低于100kb的水平(Zhong等1996b)。由此可见,以粗线期染色体作为靶DNA载体,不仅可以在不破坏染色体结构的情况下大大提高FISH的分辨率,还可弥补中期染色体不能识别单条染色体的缺陷。不过,FISH在粗线期染色体上的应用还要取决于制片技术的难易程度,对于有些动植物种类,提取性细胞是很困难的。