反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用(4)

2021-01-20 23:31

3.2病原体的检测

自从PCR技术问世以来,病原体检测得以快速而方便的进行。有些病原体如肺炎链球菌临床上主要依靠细菌培养法确诊,而且肺炎链球菌是苛养菌,营养要求高,培养时间长,尤其是患者使用抗生素后常常出现假阴性结果[12],因此临床上急需一种更为快速、准确的诊断方法。樊慧珍等[12]建立了快速检测肺炎链球菌的PCR-RDB方法。利用肺炎链球菌特异的自溶素基因序列设计引物[13],PCR合成一段263bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针进行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测,可检测到10ng的细菌DNA。该方法使得肺炎链球菌检出率高,敏感性和特异性都很好。RDB还可以同时检测多种性传播疾病(STDs)。丁守怡等[14] 研制的低密度基因芯片可同时检测HIV-1、HSV-2、HPV6和HPV11,并且特异性好,敏感度试验可检出20 fg的病毒DNA。

流行病学研究要求对沙眼衣原体的血清型进行鉴定并检测其混合感染。目前已报道有17种血清型可以引起眼部和性传播疾病[15,16]。大多数检测方法以抗体为基础,如FA染色,酶联免疫测定或放射免疫测定等,这类方法需要细胞培养,而且如果样本是尿液或阴道拭子时,上述方法不能准确检测。Diane [17]用RDB技术检测上述样本来源中的多种血清型。运用PCR扩增Ompl基因(编码主要衣原体外膜蛋白的遗传标志),然后将标记的扩增产物与血清特异型的寡核苷酸探针杂交。由于不需要对衣原体的培养和克隆,RDB对其检测是一项简便而有效的技术,尤其是在不能得到血清型的抗体或者不能进行衣原体培养的情况下。

3.3 基因分型

基因分型在临床上有很重要的应用。以HBV为例[18],HBV基因具有高度变异性,个体间的HBV基因型差异造成致病性的差异。国内外常用的基因分型方法包括;RFLP、PCR-SSOP、DNA sequence等。这些方法都各有其优点,但都存在技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率不足等问题。因此,迫切需要一种操作简单,检测时间短,分型范围广,准确性高而且实用性好的技术。在这一要求下,RDB受到广泛的关注。

HPV是迄今已被肯定的少数DNA肿瘤病毒之一,在女性下生殖道肿瘤的检出率达到了90%。HPV的异质性很大,用目前国内外传统的DNA诊断方法诊断未知样本的基因需要逐一筛查才能最后确定感染病毒的基因型。何桂蓉等[19]对160份HPV标本进行检测,以HC-2作为“金标准”,比较了HC-2与RDB的实验结果,RDB的敏感度与特异度分别为97.30%,93.02%,假阳性率为6.98%,假阴性率为2.70%,阳性预测值为92.31%,阴性预测值为97.56%,两方法的一致性为95.00%。

RDB在HBV分型中也显示出优越性。杨光等[4]根据HBV已知的6个亚型设计特异性探针和通用探针,对通过300例HBV DNA阳性血清标本的基因分型,利用PCR-RDB技术所建立的HBV基因分型方法进行了评价,包括80份HBV在103拷贝/ml的低病毒量血清在内的全部血清均能被明确分型,并与测序分型结果完全一致;50份健康人HBV 阴性血清均未出现假阳性;表明本研究建立的反向斑点杂交HBV基因分型方法具有很好的灵敏度和特异性。随机抽取的100份血清应用PCR-RDB方法再次分型,实验结果符合率为100%。值得注意的是,这种方法检测到的混合型发现的多数病例的蓝色斑点呈现出一强一弱的特点,研究者认为:这可能是因为其中一个为优势基因型,另一个为劣势基因型。


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