2.2沉淀分离 2.2.1 盐析沉淀 盐析曲线的制作：
a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5 ml；
b.分别向1～5号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1～7、7，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。
c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1mol/L（pH7.0）缓冲溶液溶解沉淀物； d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用DNS测定还原糖。
e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和酶活力的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和酶活力盐析曲线。
盐析制备蔗糖酶
①根据盐析曲线选择硫酸铵饱和度(30～40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(约60%饱和度)沉淀酶蛋白。并计算每升溶液达到30～40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据酶蛋白粗提液的体积计算30～40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。
②在酶蛋白粗提液中加入经研细的(NH4)2SO4粉末 ,使其达到30～40%饱和度,充分溶解后,4℃，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。收集上清夜。
③继续向上清液中加入(NH4)2SO4粉末，使其达到 60 %饱和度 ,充分溶解后，4℃，10000 r/min ,离心 20 min ,弃去上清液，收集沉淀。
④-I将沉淀溶于少量缓冲溶液中 ,充分混均 ,4 ℃透析约12 h后,进一步纯化。（取5mL用于蛋白含量测定和纯度分析） 2.2.2乙醇沉淀
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乙醇沉淀曲线的制备：方法同盐析曲线的制作
乙醇沉淀：在细胞破碎的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达 30%, 4℃放置过夜,4℃，10000 r/ min 离心20min ,取上清液 ,再追加乙醇使其终质量分数达 50 %。4 ℃放置 1 h ,4℃、10000r/ min 离心 20 min ,弃上清液 ,沉淀用蒸水溶解,4℃保存，必要时透析。（pH值为7.0的0.05mol／L Tris-HCl缓冲液）。
2.3层析分离
2.3.1 DEAE-纤维素柱层析
DEAE-纤维素( DE 52) 经常规处理后,装柱( 100mm×10mm) , 用起始缓冲液0.05MTris-HCl pH7.3缓冲液平衡, 调节流速为每2min 1mL,按照3-5%的床体积加样, 先用0.05MTris-HCl缓冲液洗脱,然后盐度梯度洗脱,由0.05MTris-HClpH7.3 缓冲液到0.1MNaCl的0.05MTr is-HClpH7.3 缓冲液, 每管收集3mL, 约120min 流动相，在280nm处进行紫外检测，获得洗脱曲线，同时测定峰管的酶活力，将最高酶活力的若干管酶液集中，分装后低温保存，用于性质测定。留2 mL酶液测酶活和蛋白含量。 2.3.2 Sephadex G-150柱层析
选用φ15×600～800mm Sephadex G-150层析柱，加样量为 3～5mL （约含蛋白100mg）用 20mmol/L （pH为7.0 ）的缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5～1.0mL/min，每管收集3ml，约25～30管，各管可用 A280 的紫外线进行检测，获得洗脱曲线，同时测定峰管酶活力。将最高酶活力的若干管酶液集中，分装后低温保存，用于性质测定。留2 mL酶液测酶活和蛋白含量。
2.4 冷冻干燥
将经过DEAE-纤维素柱层析或Q Sepharose 柱层析或Sephadex G-150柱层析收集的酶溶液放入冻存管中，至于-80℃冰箱中预冻4h以上，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥，直至成冻干粉。
3.结果与讨论
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3.1细胞产量：湿细胞、干细胞
3.2酶活力、蛋白质浓度的测定
3.3盐析曲线、乙醇沉淀曲线、层析洗脱曲线
3.4酶提取纯化进程结果汇总表
3.5酶纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.6理化性质分析
参考文献：
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