原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项
材料
（一） 仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机
（二） 器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管 （三） 试剂：
1． DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC）
3． 0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml 4． 20%冰醋酸 20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml 5． 蛋白酶（50μg/ml）
6． 溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100
取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min
7． 溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。 8． 4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。4℃保存。 9． 去离子甲酰胺：新的。
10． 20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。取175.32g NaCl，加ddH2O，充分溶解后，加88.2gSSC，溶解后加ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。 11． 硫酸葡聚糖（1mg/ml）,取硫酸葡聚糖1g溶于1ml灭菌水，-20℃下保存。
12． 50×Denhart液：含1% BSA，1% Ficoll-400(水溶性聚蔗糖)，1% PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），分别称取1g BSA，1g PVP-40，1g Ficoll-400，用少量的ddH2O溶解混合，加ddH2O至100ml。过滤灭菌，贮存于-20℃下备用。
13． 亲和素---碱性磷酸酶（Av-AP） 200U/200μl 14． 底物显色液
15． 50%甲酰胺 50ml甲酰胺，加50ml 2×SSC，混匀后备用。
16． 0.1mol/L pH 7.4 PBS.。称取43.2g Na2PO4·2H2O,溶于少量ddH2O，分别溶解后将二者合并，加入127.5g NaCl至完全溶解，加ddH2O至1500ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。使用时作10倍稀释。
17． 2%BSA。取0.1g BSA，溶于5ml溶液I中。
杂交前标本处理
试剂配制与准备
A 0.1mol/L PBS, pH 7.0 B 0.2% DEPC C 4%多聚甲醛 D 0.1mol/L HCl
E 200μg/ml RNase A F 蛋白酶K，稀释成含0.5-1μg/ml, 必要时用1-3或5μg/ml(用10 mg/ml贮存液稀释)
G 0.1%甘氨酸, 用0.1mol/L PBS, pH 7.5配制 H 2×SSC, 1×SSC, 用20×SSC贮存液稀释配制
I 0.1mol/L 三乙醇胺 HCl-NaOH缓冲液，pH 8.0
J 0.25%醋酐，用0.1mol/L三乙醇胺HCl-NaOH, pH 8.0配制（临用前）
K 50 mmol/L Levamisole液（碱性磷酸酶抑制剂） 4℃保存，使用时稀释成5mmol/L
操作程序
（一）杂交前处理
1. 细胞制片或切片取出冰箱, 恢复室温, 0.1mol/L PBS pH 7.0 漂洗.未脱蜡者先脱蜡,入水再漂洗。
2. 检测RNA用，0.2TPC漂洗1分钟。 3. 4%多聚甲醛室温固定5min（前固定）。 4. 0.1mol/L PBS pH 7.0 漂洗 2次。
5. 应用非放射性标记探针需灭活内源性酶者，按免疫组化方法处理。 6. 0.1mol/L PBS pH 7.0 漂洗 2次，每次3min。
7. 0.1mol/L HCl室温下处理10min, 0.1mol/L PBS漂洗2次，此步骤不能省掉。
9. 蛋白酶K 37℃消化5-10min,福尔马林固定石蜡切片组织可用1-3μg/ml/，可适当延长消化时间，但不能处理过分。消化完毕立即用0.1%-0.2%甘氨酸泡洗1分钟终止蛋白酶K 10. 0.1mol/L PBS pH 7.0 漂洗 2次。
11. 检测DNA按照此步骤： DNA：制片于1×SSC中，100℃沸水中变性5min，立即入冰浴的1×SSC中5min。
12. 4%多聚甲醛0-4℃固定15min.，（后固定），很重要 13. 0.1mol/L PBS pH 7.0 漂洗1次-2次（4℃）×5min.
14. 0.1mol/L三乙醇胺缓冲液（仅是平衡作用，可以省掉此步骤）， pH8。0 过洗1 次。 15. 新配的 0.25%醋酐中乙酰化10min 16. 2×SSC漂洗（室温）2次，每次5min 17. 梯度酒精脱水，室温下干燥。 （二）预杂交与杂交 A 配制标记探针
非同位素标记的探针可配成50ng-100ng/μl B 配制杂交液与预杂交液
预杂交液仅无标记探针，余相同。
杂交液：（50ml） 用量 终浓度 100%去离子甲酰胺 25ml 50% 100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10% 100×Denhard's 0.5ml 1
1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm 5M NaCl 3ml 0.3M
0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM 10mg/ml 变性鱼精DNA 0.5ml 100ug/ml ddH2O定容至25ml
C. 2×SSC 用20×SSC稀释10倍
操作：
1。将处理好的玻片用清洁滴管轻轻吹拭标本表面，以除去可能的灰尘后放入温盒内，温盒中滤纸上吸滞2×SSC
2．将预杂交液滴铺满标本表面，在温盒内，室温下或42℃下预杂交30min-2 h。 3. 去预杂交液，甩净
4．将杂交液滴于标本上，每片约20-30μl，用硅化的盖玻片盖上，去除气泡，平放于温盒内进行杂交。杂交温度：37℃左右。杂交时间：DNA探针过夜，寡核苷酸探针半天。 （三）杂交后处理
（1） 2×SSC轻轻冲洗下盖玻片
（2） 用含1mmol/L DTT的2×SSC漂洗15min （3） 含0.1%Triton X100的2×SSC漂洗15min （4） 2×SSC洗15min （5） RNase A处理15min
（6） 用2×SSC漂洗2次，每次10min
（7） 同上用0.3mol/L乙酸铵配制的梯度乙醇脱水，空气中干燥。 显色：
试剂配制及准备：
A． 洗涤缓冲液 含100mmol/L Tris-HCl，pH 7.5; 150mmol/L NaCl 配法：1mol/L Tris-HCl 缓冲液, pH 7.5 50ml 5mol/L NaCl 15ml 去离子水加至500ml B．封闭液
用洗涤缓冲液将试剂盒内的封闭液作0.5%稀释。因其溶液较慢，故应在操作前1h在50-70℃下稀释。
C。用洗涤缓冲液1将试剂盒内抗地高辛抗体复合物作1：5000稀释
D．AP底物缓冲液。1×AP：含0.1mol/L Tris, pH9.5; 0.1mol/L NaCl; 5mmol/L MgCl2 配法：1mol/L Tris-base 50ml 5mol/L NaCl 10ml 1mol/L MgCl2 2.5ml 加去离子水至400ml E．NBT-BCIP工作液。
F．终止缓冲液。含10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 1mmol/L EDTA
配法：1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0 1ml; 0.5mol/L EDTA 0.2ml; 去离子水100ml 操作程序： （1）。地高辛标记的杂交片经充分漂洗后，在洗涤缓冲液（试剂盒中缓冲液1）中漂洗浸泡1min；
（2）封闭液（buffer2配）浸泡30min室温，或置湿盒内。 （3）洗涤缓冲液漂洗1min
（4）稀释的抗地高辛-AP结合物室温下30min （5）以洗涤缓冲液漂洗2次，每次15min
（6）AP底物缓冲液浸泡2min（平衡，即buffer3）
（7）NBT-BCIP工作液避光显色1h，必要时可延长达24h，至呈现合适的颜色（紫蓝色） （8）终止缓冲液（即buffer 4）浸泡5min （9）去离子水漂洗3次×10min （10）如有必要可复染
（11）去离子水漂洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX或加拿大胶封片。 （12）显示：图像分析检测仪。
（13）对照实验和ISHH结果的判断。