特征：①新生正链与亲本正链总是连在一起；②滚环复制的DNA图形看似“?”字母；③前导链的启动不需要引物，也不需要转录激活，直接在3’—OH端切口上启动复制，整个复制过程只有一个复制叉（单项复制）。
7.研究表明小麦成熟胚，未成熟幼胚，幼嫩花序，叶片细胞中端粒DNA的长度分别为30 kb，80kb, 45kb, 23kb。请讨论这一研究结果的分子生物学机理。（8分）
随着组织、细胞的老化，染色体端粒DNA的长度逐渐缩短。 真核生物发育终端的体细胞中端粒酶基因表达如果受到抑制，将会导致体细胞中染色体DNA一代一代的短缩，当短缩至一个重要的信号序列处，就会引起细胞的早衰或死亡。
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8.某一质粒载体具有 Tet和 Kan的表型，（四环素和卡那霉素）在 Kan抗性基因内有一Bgl Ⅰ的切点。现用Bgl Ⅰ切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插人片段的重组体? 1>转化后涂皿时应加四环素。（用Bgl Ⅰ切割该载体，破坏了Kan抗性基因。） 2>培养后长出的菌落具有Tetr Kans和Tetr Kanr的抗性基因型。
3>重新点种在含四环素和卡那霉素的平板上，然后点种在只含四环素的平板上，选择只在四环素平板上生长的菌落（能在四环素平板上生长而不能再含四环素和卡那霉素的平板上生长的菌落），即为所需的重组体（Tetr Kans）。
第四章
二、 问答题:
1 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列。 原核生物启动子：上游控制元件（UCE）+核心启动子=扩展的启动子
UCE:即-40～-70区,能与CAP-cAMP复合物结合，是激活转录的正调控位点。 核心启动子：①-35区：Sextama盒，是RNA聚合酶首先识别和结合的位点（R site），或松弛结合位点。保守序列TTGACA,保守序列突变影响?因子结合效率； ②-10区：Pribnow盒，是RNA聚合酶随后滑到区域的结合位点（B site）,或紧密结合位点。保守序列TATAAT,保守序列突变影响开放复合物形成的速度，富含AT，解链发生区；③+1位点：转录起始点（I site），几乎均为嘌呤（A或P）。④-35区和-10区间有17±1bp的间隔序列，其保守性有利于RNA聚合酶的启动，保证了-35区和-10区能与?因子同时作用，为RNA转录提供恒定DNA双链解链区间，17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要，间距的突变趋近17bp时，表现为上调突变，远离17bp时，表现为下调突变。启动子序列与-35区序列为TTGACA及-10区序列为TATAAT的标准启动子序列同源性程度的大小决定了启动子的强弱。
保守序列：指DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，它们在进
化过程中基本保持不变。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。从跨种保留的角度来看，这种序列的存在意味着在形成不同物种的进化过程中，有一段特殊的基因序列被保留了下来。
2.简述原核生物RNA聚合酶全酶的组成以及各个亚基的功能。
RNA聚合酶全酶：5个亚基，?、?、?、?'和?，依靠空间结构专一性与特异性地与DNA结合。 ①?亚基：结合核心酶启动转录后脱离核心酶，使核心酶促延伸。可重复使用； 使全酶识别Sextama Box（R位点）、Pribnow(B位点),选择并紧密与模板链发生特异性结合，保证了相对较高的转录效率；
修饰RNA聚合酶的构型：降低全酶与DNA的非专一性结合力，增强全酶与R, B site的专一性结合力，导致RNA链的延伸缓慢； ②?亚基：核心酶的组建因子；
促使RNApol与DNA 模板链上游转录因子结合； 位于前端的α因子使双链解链为单链； 位于尾端的α因子使单链新聚合为双链。
③?亚基：促使RNA聚合酶聚合NTP，合成RNA链，使转录延伸；
完成 NMP之间的磷酸脂键的连接； 与RNA编辑有关；
与 Rho(ρ)因子竞争RNA 3’-end；
构成全酶后，β因子含有两个位点：起始位点（I）对利福平敏感，只专一性与ATP/GTP结合，决定了RNA的第一个核苷酸为A或G,延伸位点（E），对利福平不敏感，对NTP没有专一性，保证了RNA的延伸。
'? ④亚基：强碱性亚基；
促使RNA聚合酶与非模板链结合； 受K酶抑制。
3.原核生物与真核生物的mRNA的各有什么特点?
原核生物mRNA的特点为:1>半衰期短。原核生物中，mRNA的转录和翻译是在同一个细胞空间里同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。2>许多以多顺反子的形式存在。原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以同时编码几个多肽。3>原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的多聚A结构,原核生物起始密码子AUG上游有一被称为Ribosome Binding Site (RBS)或SD序列（Shine –Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3’端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用4>原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子; 真核生物mRNA的特点为：1>真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。mRNA以较大分子量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。2>以单顺反子形式存在 。3>真核生物mRNA的5’端存在帽子结构，除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3’端具有多聚A结构，真核生物的mRNA中，由DNA转录生成的原始转录产物-----前体mRNA，要经过5’加“帽”和3’酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可译框，通过核孔进入细胞质，作为蛋白质合成的模板。真核生物的mRNA还可以通过RNA编辑在初级转录物上增加、删除或取代某些核苷酸而改变遗传信。４＞真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。
4.β-地中海贫血症患者不能合成β-球蛋白。将患者与正常人β-球蛋白基因的DNA序列进行比较分析发现，除第一个intron中有一个碱基发生了改变外，所有序列相同，但其mRNA分子比正常人多出约100多个核苷酸。根据这一结果，说明患者缺失β-球蛋白的原因。
第一个intron中有一个碱基发生了改变，使得RNA加工过程中，对内含子的识别和剪接出现错误，剪接不完全，导致成熟mRNA比正常mRNA核苷酸多，编码蛋白质时可能对密码子的识别出现错位，也可能编码的蛋白质无法形成正常β-球蛋白的空间构像等，最后使患者缺失β-球蛋白。
5 说明研究两个已知蛋白质间相互作用关系的酵母双杂交技术的分子生物学原理。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结
合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。菌株具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
6 举三例RNA的研究成就并说明其在推动分子生物学发展中的重要意义。 7.说明constitutive splicing与alternative splicing, cis-splicing与trans-splicing之间在概念及机制上的区别。
组成型剪接：真核细胞在正常生理条件下发生的常规的RNA剪接。
选择型（可变）剪接：mRNA前体的不同剪接方式。其中的某个或某些外显子被代替、添加或删除，结果一个基因可产生多种信使核糖核酸（mRNA），从而翻译得到多种蛋白质。
顺式剪接：将一个信使核糖核酸（mRNA）前体中的各个内含子切除，并将相互邻近的各个外显子加以连接，形成成熟的mRNA的过程。在这个过程中，各个外显子都来自同一个mRNA分子。
反式剪接：由两个分立的RNA分子各失去一部分序列而连接为成熟的剪接产物。两种独立的基因产物，不产生共线性的中间产物，通过一系列的磷酸转酯反应，直接将两个外显子剪接在一起。 顺式剪接与反式剪接的区别见P170
8.简述前体mRNA经过剪接形成mRNA的过程；9.核内mRNA前体是按 GU／AG规则进行剪接的，还有什么机制可以从RNA初级转录物中剪接内含子? 10.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?
-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA聚合酶起始位点)启动子序列和终止子 11.什么是可变剪接？它是怎样造成：
(1)在不同的组织中基因活性不同？(2)单个基因翻译产生两个不同的多肽？
12.什么是增强子? 它们与其他调控序列有何不同? 增强子具有哪些特点?
增强子：可强烈促进一个或几个基因转录的DNA元件，增强子通常位于作用基因的上游，但当它们被反转或移到几百甚至几千碱基对外时，也能发挥作用。 ①可以从非常远的距离使它的靶基因转录活性增加达1000倍；
②作用不依赖方向和位置，可位于基因的上游、下游甚至所调节基因的内部，通过使内部成环突出而实现与基本转录装置相互作用，能同时影响两侧两个基因的表达； ③必须与受调控的基因位于同一DNA分子中，但可位于任一条DNA链上；
④包含有功能的成簇的功能位点群--增强子元。可调节多个启动子，没有基因特异性，可以对其进行克隆、重组和转移；
⑤有组织和细胞的特异性，其表达需要特异蛋白因子的作用； ⑥优先作用于最邻近启动子的转录；
⑦与增强子结合的蛋白包括激素受体蛋白，因而，发育过程中增强子可能在基因活性的调控中起重要作用
13.说明真核生物前体 RNA加工的类别及机理。
14.在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么?
酚可以使蛋白质变性，同时酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），用酚处理匀浆时，蛋白质分子溶于酚相，DNA溶于水相，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。另外，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多。
15.一个基因如何产生两种不同类型的mRNA分子?
第一种是：一个原初产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，能产生具不同3’端的mRNA。第二种是：如果一个原初转录产物含有几个外显子，发生选择性，产生多种mRNA，编码同源异型蛋白质。
16.什么是转录起始前复合体?
参与真核生物转录起始的第一步是TFIID因子对TATA盒的识别，TFIID是一组蛋白质的复合体，它包括了TATA盒结合蛋白(TBP)和至少8个以上的TBP辅助因子（TAF），TBP通过DNA的小沟与TATA盒发生专一性作用，并且使小沟变宽，TFIIA作为一种TAF,与TFIID和其中的TBP结合，能增强并稳定TFIID与TATA盒的结合，形成“前转录起始复合体”（pre-TIC）。
17.为什么把同样的第一外显子(SL外显子)加在所有mRNA上对锥虫是有利的? SL RNA的迷你外显子含有ATG-启动子，它是完整mRNA拥有正确的开放阅读框（open reading frame）的前提。
18.将带有启动子和终止子在内的玉米Adh完整基因导入E. coli细胞内没有得到表达，其主要原因是什么？
玉米基因属于真核基因，含有内含子，而E.coli属于原核细胞，不含有将Adh基因前转录物进行RNA加工（包括5’端加帽，3’端加尾，内含子剪接，RNA编辑和内部腺嘌呤甲基化）所需的酶系，故即使有转录物，也不能翻译出用功能的蛋白，即无法得到表达。
19.有一个被认为是 mRNA的核苷酸序列，长300个碱基，你怎样才能： (1)证明此RNA是mRNA而不是 tRNA或rRNA。 (2)确定它是真核还是原核mRNA。
20.包含?? 的E.coli RNA聚合酶全酶识别的一个的E.coli启动子-10 框的非模板序列为5’-CATAGT-3’，（a）在第一个位置发生的C→T突变是Up-mutation还是Down-mutation？为什么？ （b）在最后位置发生的T→A突变，是Up-mutation还是Down-mutation？为什么？
（a）Up-mutation,C→T使三个氢键连接变为两个氢键连接，双螺旋稳定性减弱，易解链，而-10框正好是原核生物启动子的解链区域，即表现为转录率上升，上调突变。（b）可能Up-mutation也可能Down-mutation也可能不变，T→A突变并没有改变键的个数即双螺旋的稳定性，只能猜测可能的情况。 21.根据提供的（a）mouse total DNA × mouse globin pre-mRNA ，
??
（b）mouse total DNA × mature mouse globin mRNA 杂交的电镜图像，说明你
得到的信息。