13.PA培养基通常用来培养真菌__菌,其pH值为5-6_。
14.牛肉膏、蛋白胨培养基通常用来培养_细菌,其pH值为_、7.0-7.2__。 15.无氮培养基通常用来培养自生固氮菌。其氮源来自_空气中的N2_。 16.干热灭菌的工艺条件是160-170℃/2h_。
17.使用显微镜低倍镜观察时,聚光器应该降低,使用显微镜高倍镜观察时,聚光器应该适当升高。
18.革兰氏染色的关键操作是酒精脱色_。
19.显微镜的倍数越大,焦深越小,调焦应该越小心_。
20.按培养基的形态,可将培养基分为液体_,固体_,半固体__三种类型。 21.配制常规培养基时通常用_自来_水。
22.热灭菌通常用来灭菌玻璃器材,培养基的灭菌通常用_高压蒸汽灭菌。 23.细菌稀释测数通常采用10倍__稀释法,稀释用试管无菌水为9__毫升。 24.配制培养基时常用_1molNaOH、和1molHCL调节pH值。
25.按培养基的特殊用途,可将培养基分成__选择培养基,加富培养基,鉴别培养基等。
26.选择培养基可用来分离培养我们所需的特殊微生物类群,例如我们要从土壤中分离纤维分解菌,可以利用_纤维素_作唯一碳源来筛选纤维分_解菌___；要分离产蛋白酶的微生物,可以利用酪蛋白,作唯一氮源分离_蛋白分解菌_。
27．革兰氏染色的操作程序是涂片,干燥,固定,结晶紫染色1分钟,水洗,碘液媒染1分钟,水洗,95%的乙醇脱色25秒,水洗,蕃红复染3-5分钟,水洗,晾干__。
28.培养基是人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。按营养物质的不同来源可分为_天然培养基,合成培养基,半合成培养基__三大类。 29.高倍镜头的数值孔径通常为_0.65,,放大倍数为_40x__。
30.油镜头的数值孔径通常为_1.25,放大倍数为_100x或90x__。 31.低倍镜头的数值孔径通常是0.25__,放大倍数为_10x或8x__。
32.穿刺接种使用的接种工具为__接种针,斜面接种使用的接种工具为接种环__。
33.进行稀释测数使用的主要器材有__酒精灯,1ml无菌吸管,9ml试管装无菌水,9cm的无菌平板
34.用孔雀绿和复红作细菌芽胞染色时,可使菌体呈红色,使芽胞呈_绿色。
35.用日光灯作光源时,通常用_平面反光镜,用自然光作光源时,通常用凹面__反光镜 36.无菌室杀菌通常采用紫外灯照射,和喷洒化学药剂(如酚)相结合的方法。 37.半固体培养基通常用来检查_细菌的运动性。
38.摆试管斜面的基本操作方法是将摆斜面用特制木条放在桌面上,将装有固体培养基的试管趁热放在特制木条上摆成斜面,斜面长度不得超过试管长度的1/2,将试管棉塞部分用灭菌报纸盖上,以防空气中微生物落到棉塞上引起污染。
39不能加热灭菌的液体培养基应采用滤法除菌,通常用的器皿有蔡氏细菌过滤滤和膜滤_。 40.蓝细菌的培养可用膜滤_培养基。
41.分离酵母菌时为了抑制细菌的生长,通常用_膜培养基。
42.从土壤中分离真菌时,通常在培养基中加入_孟加拉红和_链霉素显_抑制细菌的生长。 43.测微生物的大小使用的主要工具是微镜,镜台测微尺和_目镜测微尺。 44.测微生物的数量使用的主要工具是_显微镜和血球计数板_。
45.进行细菌的显微计数时使用的主要工具是显微镜和细菌计数板_。
46.普通光学显微镜测酵母菌的大小的操作程序是将镜台测微尺置载物台上,调焦找到台尺,在低倍镜下校正目镜测微尺每格的长,在高倍镜下校正目镜测微尺每格的长,去掉台尺换上待测样本片,在高倍镜下测出十个酵母菌宽和长的格数,将校正值乘入,算出十个酵母菌的平均
宽和平均长,以平均宽x *??平均长Y(μm)表示酵母菌的大小。
47.显微计数的操作程序是_将待测菌进行适当的稀释,将计数板置于载物台上,在低倍镜下找到计数区,将菌液加到计数区上,调焦看到菌体,按五点取样法计数五个大方格的菌数,计算每小格的含菌数,计算出单位体积(如每ml)中的含菌数。
48.荚膜染色法的操作程序是_涂片,风干,加复红染色3-5分钟,水洗,晾干,加墨素涂抹,风干。 49.芽胞染色的操作程序是片,干燥,固定,
孔雀绿加热染色15分钟,水洗,复红染色2-3分钟, 水洗, 晾干。
50.芽胞染色的关键操作是孔雀绿加热染色_。
51.放线菌印片染色的关键操作是_印片时不能移动__。 52.用负染色法染荚膜的关键操作是_涂抹墨素要薄。
53.摇床振荡培养通常用来培养_好气微生物,享格特的厌氧操作方法通常用来培养专性厌氧菌
54.革兰氏染色反应与细菌细胞壁的_结构_和__组成_有关。在革兰氏染色过程中,当用95%酒精处理后,就放在显微镜下观察,革兰氏阳性菌呈_紫_色,而革兰氏阴性菌呈_无色。 55.血球计数板与细菌计数板的主要差别是前者计数区的深度是后者的五倍 56.制霉菌水浸片时加棉兰染色液可使菌体呈_浅兰色。
57.Anabaenaazo对ica的异型胞通常是_间生在光学显微镜下它是_透明的,细胞两端有极节_。它能控制氧气的进入,保持异型胞内_低氧分压,以利于固定分子氮_。 58.配制培养基时,应注意各种营养物质的配比,特别是C:N比(碳氮比)。一般而言,当C:N?5:1时,有利于_菌体生长；当C:N?5:1时,有利于__积累代谢产物。
59.由于各种微生物对某种化合物如抗生素、染料的敏感性不同,可以利用这一特征来从土壤中分离出不同类群的微生物。如在培养基中加入青霉素(链霉素),会杀死或抑制细菌和放线菌的生长而分离出真菌__；在培养基中加入__结晶紫__,有利于分离到革兰氏阴性菌。
60．细菌在革兰氏染色过程中,最后用蕃红复染的原因是G-细菌经结晶紫染色、碘液媒染、酒精脱色后菌体紫色脱去,故需用蕃红复染,这样在光镜下才能见到红色的菌体。
61.高倍镜下能看到的物象在油镜下看不到往往是由于_片置反和_菌体着色太浅引起。 62.微生物在培养基中生长时,由于其_新陈代谢而使培养基_pH值发生改变；所以在配制培养基时,为维持该条件的相对恒定,常在培养基中加入缓冲物质如_碳酸盐(CaCO3)_或_磷酸盐 63.一般而言,微生物在含糖基质上生长,会产_酸_,而使_pH下降_；微生物分解蛋白质或氨基酸会产_碱_,而使_pH上升.
64.在微生物培养过程中使用的培养皿首先是被_Petri采用的,因此又称培养皿为_Petri_dish。Hesse在其妻子的启发下,将固体培养基使用的凝固剂由明胶改为_琼脂 65.显微镜的微动螺旋每转一圈升降距离为_0.1毫米
66.两个典型的革兰氏正反应细菌和革兰氏负反应细菌经革兰氏染色后都呈阴性反应往往是由于_酒精脱色时间过长和__菌体培养时间太长引起。
67.检查乳品和饮料是否含有_大肠杆菌(E.Coli)_等肠道细菌,可采用_伊红--美兰_培养基,在这种培养基平板上_大肠杆菌(E.Coli)__会形成具有_金属___光泽的紫黑色小菌落。 68.细菌鞭毛经镀银法染色后呈_褐_色。 69.细菌鞭毛经李夫森法染色后呈_红色。
70.由于升汞(HgCL2)有腐蚀作用,所以不能用于金属器皿消毒,特别是_铝制品。
实验技术 思考题
01.试述在普通光学显微镜下测定微生物细胞大小的基本方法。 测定微生物细胞的大小主要使用目镜测微尺。其方法如下: 1.先用长度已知的镜台测微尺校正目镜测微尺。校正的方法是让台尺与目尺重叠,看台尺的X
x?10?m格正好与目尺的Y格重叠,然后用
y计算目尺每格的长.分别校正目镜测微尺在低倍镜,
高倍镜及油镜下每格所代表的实际长度。
2.将待测微生物制成水浸片或染色涂片置载物台上,调焦找到微生物后用目镜测微尺测量其宽几格,长几格,然后乘上相应放大倍数下的校正值。 3.一般测10个微生物,然后以平均值表示。 4.若是酵母、细菌等单细胞微生物,通常测其宽和长,然后以平均宽?平均长表示,单位为μm。 02．以测苏云金杆菌工业菌粉中的活菌数为例,试述稀释平板计数的基本方法。
1.测数前先准备好测数用的1ml无菌吸管,9cm无菌平板,9ml试管无菌水和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
2.称取10克工业菌粉加入90ml无菌水中置摇床上或用手振荡20-30分钟,让菌体分散。 3.将上述振荡过的菌液按无菌操作法进行十倍稀释直到10-8。
4.取9cm无菌平板9套用记号笔在平板底编号,10-8编3套,10-7编3套,10-6编3套。 5.用1支1ml的无菌吸管,取1ml10-8的稀释菌液放入编号10-8的平板中,如此将三个重复做完.同法取10-7稀释菌液放入三个编号为10-7平板中.同法取10-6稀释菌液放入三个编号为10-6平板中.(均要按无菌操作法做)。
6.将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基熔化冷至45-50℃后,在酒精灯火焰边按无菌操作法倒入上述9套平板中,每个加入量大约15-20ml,边加边摇动平板,使培养基与菌液充分混匀。 7.待培养基凝固后,将平板倒过来,置28-30℃下培养48小时后计数。 03.试述划线分离的操作方法。
1.取9ml无菌平板一套在火焰旁按无菌操作法倒人15-20ml营养琼脂,让其冷凝成平板。 2.左手拿上述平板,右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取原始分离物在平板上平行划线三条 3.将接种环在火焰上灭菌,左手平板转动大约70度,用灭菌接种环通过第一次划线的地方作二次划线,亦划三条。
4.同上法再作第三次,第四次划线。
5.盖上平板盖,将平板倒过来置28-30℃下培养2-4天后观察结果.划的好应在第四次划线处出现单个菌落。
注:本答案也可画图说明。
04.试述检查细菌的运动性的操作方法。 检查细菌的运动性有两种方法: 1.镜检法
将待检样品制成菌悬液,滴一点菌液于一盖玻片上,取一凹窝载玻片,将凹窝对准菌悬液盖在盖玻片上,然后将盖玻片和载玻片一起翻转,让菌悬液在凹窝上的盖玻片下.然后在显微镜下观察,观察应找悬液的边缘.因细菌为了更多地接触空气,总向水滴的边缘运动,观察时要注意将细菌的运动与分子的布朗运动区别开。 2.半固体穿刺法
将待检细菌穿刺接种在半固体试管培养基中,若细菌仅沿穿刺线生长,说明细菌不运动。若细菌沿穿刺线向周围扩散生长,说明细菌有运动性。
05．简述配制培养基的基本原则:培养基是人工配制的适合不同微生物生长繁殖,或用于积累代谢产物的营养基质。所以配制培养基时应注意以下原则:
1.根据微生物的不同选用不同的培养基,以满足微生物对营养物的需要。如自养型微生物所要求营养较简单,而异养型微生物营养要求较复杂。培养细菌,放线菌,真菌等各有不同的培养基。
2。注意各种营养物质的浓度与配比。微生物生长所需要的营养物质往往在适当时才生长良好。浓度大往往会抑制微生物的生长。如糖类,各种重金属盐类如果浓度太高,也会影响微生物的生长。同时各种营养物质的浓度比也应注意,特别是C/N比。
3.注意将培养基的pH值控制在一定范围内。为了防止因微生物生长繁殖或积累代谢产物后影响培养基pH值,常在其中加入磷酸盐,碳酸盐,以维持培养基pH值的相对恒定。 4.同时还应考虑培养基的氧化还原电位及原材料的经济、易购和来源广泛的原则。 06．试述配制培养基的基本过程及应该注意的问题。 配制培养基的基本过程是:
1.按培养基的配方称取各种药品,用量太少的药品应配制成溶液后再取一定量加入。 2.将各种药品加水溶解,通常是加所需水量的一半。
3.若配固体培养基,按2%的用量称取琼脂,用水将琼脂浸湿一下,用手挤去琼脂中过多的水分,加入2的溶液中。
4.加热至琼脂全部溶解,并补足所需的全部水量。 5.用1molNaOH和1molHCL调节pH至要求值。
6.用分装器将培养基分装入试管或三角瓶中,塞上棉塞并包扎,灭菌后备用。 注意事项:
1.配制过程中,在加热熔化琼脂时,要不断搅拌,以防糊底。
2.分装时不要让培养基沾染试管口或瓶口,以防培养过程中容易污染杂菌。 07.试述显微计数的基本方法。
显微计数通常用来测微生物单细胞的数量,大一点的细胞如酵母菌用血球计数板,小一点的细胞如细菌用细菌计数板。该测数方法不能区别死活细胞,测出的是微生物总的细胞数量。 血球计数板和细菌计数板构造相似,计数区的面积都是1mm2,两者的差别在于血球计数板的深度为0.1mm。细菌计数板的深度为0.02mm。无论是血球计数板还是细菌计数板计数区都划为25个大方格,每个大方格又划为16个小格。所以每小格的体积为1/4000mm3或1/20000mm3。计数时,先在显微镜下找到计数区,然后将菌液稀释到适当浓度,取少量菌液滴在计数区上盖上特制盖玻片,亦可先盖盖玻片。然后用吸管将菌液从计数板上的沟里加入。靠菌液的表面张力充满计数区。计数时采取五点取样法数数,即四角各取一个大方格,再在中央取一个大方格。计数时大方格四周压线的细胞只数两边,以防增加数量。将5个大方格的菌数加起来除以80得出每个小格的菌数,再乘以4000即为1mm3的菌数,再乘上1000即为1ml的菌数,乘上稀释倍数即为样品含菌数。
08．标本片上的某一物象,第一次看到后如何再次找到它?
要做到这一点,首先取决于显微镜的好坏,若显微镜上的推动器带有纵横标尺,很容易做到这一点。首先记住标本片放到推动器上的方向,然后记下观察某一物体时推动器上的纵横标尺的数字。如纵3,横4。当标本片拿下来后,若要重复观察原来的物象,只要按原方向将标本片荚在推动器上,将推动器推动到第一次观察该物体的纵,横标尺数字纵3,横4,即可看到第一次观察过的物体。
09.试述在光学显微镜下所看到的Anabaenaazo对ica的主要特征。 Anabaenaazo对ica的主要特征是:
1.菌体为丝状体,营养细胞为绿色,藻丝不扭曲。
2.该菌有异型胞,异型胞间生,无色透明,两端有极点。 3.厚壁孢子无色、大、两端无极点。
10．革兰氏染色反应的成败关键是什么?为什么革兰氏染色有十分重要的理论与实践意义? 因通过革兰氏染色,可把几乎所有的细菌都分成G+和G-菌两大类细菌,在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异。因此,任何细菌只要通过革兰氏染色,即可提供不少重要的生物学特性方面的信息。 革兰氏染色反应的成败关键是: 1).菌龄:12-24小时的纯培养物。
2).革兰氏染色操作技术其中严格控制酒精脱色时间和菌液涂布时应均匀而薄是关键。 3).培养基的组成。
11．如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体?
首先要根据分离对象选择适宜的培养基。若要分离真菌应选用马丁-孟加拉红选择培养基；若要分离细菌应选用牛肉膏蛋白胨培养基；若要分离放线菌应选用高氏培养基。土样采回来后,用常规的十倍稀释分离法进行稀释分离,若分离细菌,一般稀至10-8,若分离放线菌,一般稀至10-6；若分离真菌,一般稀至10-4。取最后三个稀释度倒平板获得单个菌落。将平板上出现的单菌落转接斜面培养,同时镜检菌体的纯度,若不纯,应将培养的单菌落斜面再次进行稀释分离。倒平板获得单菌落,转接斜面培养,同时镜检菌体的纯度。反复几次直到得到菌体单一的单菌落方可认为是某一微生物的纯培养体。 12．察氏培养基的组成为:蔗糖:30克,磷酸氢二钾:1.0克,硝酸钠:2克,硫酸镁0.5克,氯化钾:0.5克,硫酸亚铁:0.01克,蒸馏水:1000ml. 试述:
①该培养基的C源,N源各是什么物质。 ②除C源和N源外的其它物质起什么作用: ③该培养基为什么不加生长因子?
⑴该培养基的C源物质是蔗糖,N源物质是硝酸钠。
⑵磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁为该培养基提供矿质营养。蒸馏水提供水分。 ⑶该培养基培养的微生物在培养基上能合成自身所需的全部生长因子,故无需添加生长因素,该培养基所培养的微生物为野生型。
13. 简述采用多管发酵法测定自来水大肠杆菌群的方法。
采用多管发酵法测定自来水大肠杆菌群培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水．
仪器或其他用具：载玻片，灭菌的带玻璃塞空瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 （一）自来水水样的采集：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。 （二）检查方法：
1.初(步)发酵试验 在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100m1水样。在10支含有5m1三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10 m1水样。混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
2.平板分离 经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18—24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。①深紫黑色、有金属光泽；②紫黑色、不带或略带金属光泽；③淡紫红色、中心颜色较深。
3.复发酵试验 经涂片、染色、镜检后，如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分,重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个,37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。