1.1.5.4 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制
1) 30% 丙烯酰胺（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝29:1）:700ml双蒸水中加
入290g丙烯酰胺，10g甲叉双丙烯酰胺，搅拌使完全溶解，加水定容至1000ml，4℃保存；
2) 10% 过硫酸铵：称取1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水，定容至10ml； 3) 10% 乙醇：量取50ml无水乙醇溶于450ml水中，混匀； 4) 1% HNO3：量取15ml浓HNO3溶于985ml双蒸水中，混匀；
5) 0.2% AgNO3：称取1g AgNO3溶于500ml双蒸水中，置于棕色试剂瓶； 6) 3% Na2CO3（0.05%甲醛）：称取30g无水Na2CO3溶于900ml双蒸水中，加入
1.5ml甲醛，定容至1000ml；
7) 3% HAc：量取30ml冰HAc溶于970ml双蒸水，混匀。
1.2 方法
1.2.1.山羊基因组DNA的提取
从山羊颈静脉采血10ml，放入装有抗凝剂（0.5molL EDTANa2）的离心管中，6000rmin离心15min，弃上清，吸取白细胞沉淀（参杂少量红细胞）于另一离心管中；加入两倍体积双蒸馏水（灭菌），摇匀沉淀，静置10min～15min，破碎红细胞；6000rmin离心15min，轻轻弃去上清，留白细胞沉淀；加入1×SET 5ml，蛋白酶K（10mgml）0.1ml至终浓度200ngml，10% SDS 250μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜；加入等体积饱和平衡酚轻轻摇匀，12000rmin离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下相苯酚；重复上步；加入等体积苯酚氯仿异戊醇（25:24:1），轻轻摇动10min，12000rmin离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层有机相；加入等体积氯仿异戊醇（24:1），轻轻摇动10min，12000rmin离心15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层有机相；加入两倍体积预冷无水乙醇，轻轻转动管子，DNA呈絮状析出，用1ml吸头（灭菌）吸出DNA沉
11 淀，放入1.5ml离心管中，加入预冷无水乙醇洗涤一次，离心弃去无水乙醇，再用75%乙醇漂洗2次，小心吸去乙醇，待DNA沉淀自然干燥后，加入适量TE（100μl～300μl）溶解。
1.2.2.引物设计及其序列
引物参考滑国华等（2008）进行设计，序列如下： 上游引物: 5’ACGACCCGAGGATCTATTCC 3’ 下游引物: 5’ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGATT 3’，
在下游引物中引入错配碱基A，当突变位点为G（即反义链为C）时，可形成HinfⅠ（GATTC）酶切位点；当突变位点为A（即反义链为T）时，该酶切位点缺失，由此可进行基因型判定。
1.2.3.PCR扩增及其电泳检测
1.2.3.1 PCR扩增反应体系（表2） 表2 PCR扩增反应体系（20μl）
Table 2 PCR amplification of the response system （20μl）
反应体系 response system 灭菌蒸馏水 10×Buffer Mg dNTP 上游引物 下游引物
Taq DNA聚合酶（5 Uml）
2+
反应体积V（μl） response volume（μl） 14.6 2 1.2 0.2 0.4 0.4 0.2
12 模板DNA Total
1 20
1.2.3.2 退火温度的优化
利用PCR机器上都有一个Gradient功能，在一次PCR过程中，对机器中不同位点的反应采用不同的退火温度，一般在第一次实验中，采用引物溶点上下10度设置退火温度梯度。每个温度梯度一个反应，最后电泳检测并比较各个退火温度的条带效果，得到最好结果。本试验中退火温度设定为55－65℃，结果表明，退火温度60℃时，无非特异性带，目的条带最为清晰。
1.2.3.3 PCR反应程序（表3） 表3 PCR反应程序
Table 3 PCR amplification of the response term
PCR反应条件
步骤
PCR
steps
conditions
1 2C 3C 4C 5 6
预变性 变性 退火 延伸 延伸 保温
95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃ 16℃
5min 30sec 30sec 30sec 7min 10min
reaction
temperature
time
温度
时间
第二步至第四步循环35次。 1.2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测
13 PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测， EB染色，利用BIORAD凝胶成相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。 1.2.3.4.1 琼脂糖凝胶电泳方法
（1） 灌胶
将透明胶带粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。取一烧杯，放入：琼脂糖0.75 g； 1×TAE 50 ml。混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。
（2）上样电泳
轻轻拔出梳子，将胶两头的透明胶带揭去，移入电泳槽，点样孔一侧靠近操作者，注入1×TAE缓冲液，浸没凝胶。使用微量可调采样器取3μl DNA充分混匀于适量溴酚兰，点样于1.5％琼脂糖凝胶孔内，并点3μl 600bp MarkerⅠ作为参照。点样时，加样头尖端插入上样孔内13高度，轻轻将样品推入，避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。使比重较大的样品自然沉入上样孔底。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。开启电源，电压调至100V。20～30min后检查。 1.2.3.4.2 成像分析
利用BIORAD凝胶成相系统凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。
1.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测
1.2.4.1 酶切反应体系（表4） 表4 酶切反应体系
Table 4 PCR and the amount of the components
反应体系
反应体积V（μl）
14 response system 灭菌蒸馏水 10×Buffer
response volume（μl） 4.7 1 0.3 4 10
HinfⅠ限制性内切酶
PCR产物 Total
将上述酶切体系置37℃水浴锅或恒温箱中酶切过夜。 1.2.4.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1.2.4.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
不同的实验需要优化聚丙烯酞胺凝胶的交联度和浓度，才能达到最好的实验效果，本实验采取一下方法：
1. 在小烧杯中加入18.43m1双蒸水，9.33ml 30%丙烯酞胺（29:1），7ml 的
5×TBE混匀；
2. 清洗制胶用玻璃板，烘干后用透明胶封好底边和侧边，固定在制胶用
的有机玻璃板上；
3. 向小烧杯中加入245ul的10%AP，13ul TEMED混匀后迅速灌胶； 4. 当胶灌至离玻璃板上边缘0.5cm时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下
不要有气泡，室温聚合1小时；
5. 凝胶聚合好后，拔出梳子，注射器吸出梳齿孔中未聚合的液体； 6. 取下玻璃板，撕下胶线，固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液1×TBE； 7. 在PCR产物中加入16体积上样缓冲液，用微量进样器取5u1酶切样点
样，同时点分子量标记物PBR322Mspl；
8. 上样完毕后，打开电泳议以80V电泳20min，再调到120V电泳4～5h。 1.2.4.2.2聚丙烯酰胺凝胶染色步骤
15