实验七 实验设计报告
实验名称：干旱对植物的伤害及植物对干旱的适应性调节
实验目的：（1）了解干旱对植物的伤害作用；
(2)了解植物适应干旱的生理调节；
? (3)掌握干旱对植物伤定程度的测定方法；
? (4)掌握植物适应干旱的一些生理指标的测定方法。
实验设计
逆境类型：干旱（不浇水） 逆境强度：不浇水天数
待小麦苗长到7-8厘米高时进行干旱处理。 逆境处理时间：1天，2天，3天，4天，5天， 测定指标：水分含量
逆境对植物的伤害：相对电导率（膜透性） 植物对逆境的适应调节：脯氨酸
（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定
一、目的
在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理
磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 3.1. 材料：植物叶片。
3.2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；恒温水浴
锅；滤纸；剪刀；洗耳球。 3.3.试剂及配制：
2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。
3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
10μg·ml脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。
冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤
4.1脯氨酸标准曲线的制作
4.1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
管 号 试 剂 0 10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 2.5﹪酸性茚三酮（ml） 每管脯氨酸含量（μg） 吸光度值OD[空白值： ] 0 2 2 2 0 1 0.2 1.8 2 2 2 2 0.4 1.6 2 2 4 3 0.6 1.4 2 2 6 4 0.8 1.2 2 2 8 5 1.0 1.0 2 2 10 -1
4.1.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 4．2标准曲线的绘制
以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 4.3. 样品的测定 4.3.1脯氨酸的提取
称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺
基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 4.3.2测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。
用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 五、计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
X × 提取液总量（ml）
脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝ ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml） 公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
实验数据表格1
梯度
吸光度值A
吸光度平均值
脯氨酸含量（μg·g－1Fw）
1
处理一天 2 3 1
处理两天 2
3 1
处理三天 2
3 1
处理四天 2
3
1
处理五天 2
3
1
对照
2
3
（二）相对电导率测定
一、原理
细胞膜不仅是分隔细胞质和胞外环境的屏障，而且也是细胞与环境发生物质交换的主要通道，又是细胞感受环境变化刺激的部位。细胞膜的选择透性是其维持生理功能的最重要的条件之一。各种逆境伤害都会造成质膜选择透性的改变或丧失，例如低温、冰冻、干旱脱水等导致的细胞膜机械损伤以及逆境和衰老过程中的膜脂过氧化作用，都可以增大细胞膜通透性。因此，细胞质膜透性的测定常作为植物抗性研究中的一个重要生理指标。当质膜的选择透性因逆境伤害而明显改变或丧失时，细胞内的物质(尤其是电解质)大量外渗，从而引起组织浸泡液的电导率发生变化，通过测定外渗液电导率的变化，就可反映出质膜的伤害程度和所测材料抗逆性的大小。Dexter (1930)首先用电导法测定了植物的抗冻性，经过不断地改进和完善，目前已得到广泛应用。 二、材料、仪器及试剂 2.1. 材料：植物叶片。
2.2．仪器：30ml指形管（18个），剪刀，水浴锅，试管架，电导率仪。 2.3 .试剂：去离子水 三、实验步骤
（1）取根系或植物叶片，自来水洗净，蒸馏水冲洗干净，吸干表面水分。秤取1g，剪成长约1cm小段。将材料装到30ml指形管内，加入去离子水15ml，抽真空至材料下沉，室温放置1~2h。测电导率R1。（用根系时可以不用抽真空）
（2）将指形管沸水浴15~20min（注意加盖防止水分蒸发），以充分杀死植物组织，取出放入自来水中冷却至室温，测电导率R2。 相对电导率=R1÷R2×100
实验数据表格2
梯度
电导率R1
1
平均值
电导率R2 1 2 3 1 2 3
1 2
平均值
相对电导率
处理一天 2
3 1
处理两天 2
3
处理三天
1 2
3
1
处理四天 2
3 1 处理五天 2
3 对照组
1 2 3
3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
（三）植物水分含量测定
一、原理
自然含水量= 鲜重/鲜重-干重×100％
相对含水量（Relative Water Content， RWC）
RWC =实际含水量/饱和含水量×100％=自然鲜重-干重/水饱和鲜重-干重×100％ 二、材料、仪器及试剂 2.1.材料：植物叶片
2.2.仪器：电子天平，试管（18个），剪刀，烘箱，滤纸 2.3.试剂：蒸馏水， 三、实验步骤
1、取成熟植物叶片，剪成适当大小，迅速称量鲜重Wf（~1g）。
2、将植物材料浸入蒸馏水并置于4℃冰箱中数小时至恒重（因植物材料而异） 。 3、将材料从水中取出，用吸水纸迅速吸去材料表面水分，称取其饱和鲜重Wfs。（12h以上） 4、将上述材料放入一信封内，放入烘箱中，在105℃下杀青30min，然后将温度调到80℃烘至恒重。
5、称取材料干重Wd。
实验数据表格3
梯度
处理一天
鲜重wf 1 2 3 1
平均值1 鲜重wfs 平均值2 干重wd
平均值3 RWC
处理两天 2 3 1 处理三天 2
3 1 3 1
处理四天 2
处理五天 2 3
对照组
1 2 3
注意：（1）在称量1g叶片后将叶片装入用记号笔标记的试管中，一一对应。
（2）在称量wfs时，称量一个包装一个并做好标记和记录，最后三个平行包装在一个大的报纸中进行烘焙。
（3）在称量wd时称量一个记录一个。