逆转录实验说明
一、反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择
1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及
4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
第二章 增加RT-PCR灵敏度
分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。 一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的 检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较
以5或1μg Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响
在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α-P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计
算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响 图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响
以oligo(dT)为引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum? Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物进行35个循环。 人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全长cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5μg Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。
RNaseH产生的障碍
RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。 提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。
图6 温度对不同模板的影响
使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。 表2. 逆转录保温温度
Reverse Transcriptase Incubation Temperature
AMV 37°C-45°C
M-MLV 37°C
SuperScript?II RT 37°C-50°C
ThermoScript? RT 42°C-65°C
RNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。
Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，PCR过程中Mn的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。 促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。