紫锥菊提取物中菊苣酸的提取纯化研究
菊苣酸是紫锥菊提取物中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强人体免疫力和抗炎作用。现有的高纯度菊苣酸制备工艺对生产设备要求高、不易放大，且目前只能生产对照品，这在很大程度上限制了紫锥菊提取菊苣酸生产的高效率、低成本化发展。因此，西安源森生物实验室将紫锥菊中提取纯化菊苣酸成分的工艺作为本次实验主题进行研究：
一、源森生物紫锥菊提取菊苣酸准备仪器与材料
高效液相色谱仪； L—7420紫外检测器； RE—52A旋转蒸发器； DZ—2BC型真空干燥箱；
紫锥菊根→自然干燥→粉碎； 菊苣酸对照品；
纯度94%;AB-8树脂。
二、源森生物紫锥菊提取纯化菊苣酸的方法与结果
（一）HPLC法测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量 1. 色谱条件：
色谱柱:A lltima C18(250 mm×4. 6mm, 5μm)； 流动相:乙腈-1. 8%冰醋酸(25∶75)； 体积流量: 1. 0mL /m in； 检测波长: 327 nm； 柱温: 35℃； 进样量: 5μL。 2. 标准曲线的制备：
精密称取菊苣酸对照品5. 05mg→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解并加至刻度→精密吸取对照品溶液0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0μL注入液相色谱仪中→测定峰面积。
以菊苣酸质量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得方程:Y= 401 209X+ 23 809，r= 0. 999 5，线性范围:0. 25～3. 03μg。 3. 供试品溶液的制备：
精密称取各提取物、纯化物、萃取物样品适量→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解→超声提取10 m in→加70%乙醇至刻度→过0. 45μm滤膜，即得。 4. 测定：
采用外标法进行测定。
（二）紫锥菊植物中提取菊苣酸 1. 提取溶剂的选择：
从紫锥菊植物中提取菊苣酸一般采取乙醇、甲醇或它们的水溶液。考虑到试剂价格和工业化生产的可行性，西安源森生物本实验选择乙醇作为提取溶剂。
分别称取20g紫锥菊根7份，以10倍质量的0、20%、40%、55%、70%、85%、100%乙醇水溶液在80℃加热回流提取2h→所得滤液蒸干→得紫锥菊提取物，采用HPLC测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量，并计算菊苣酸的得率。结果见图1：
由以上图1可以看出，随着乙醇体积分数的增加，紫锥菊提取物汇总菊苣酸的得率逐渐升高，当乙醇溶液的体积分数为40%时，菊苣酸的得率达最大。随后，紫锥菊提取菊苣酸的得率随乙醇体积分数的增加而降低。
这是因为紫锥菊根中含有多酚氧化酶，乙醇能使多酚氧化酶失活，当直接用水提取时，菊苣酸在几分钟之内迅速被氧化，所以用水提菊苣酸得率较低； 而乙醇体积分数的增加可阻止紫锥菊提取物中菊苣酸被氧化，但乙醇的体积分数过高时，紫锥菊药材组织内的菊苣酸在乙醇溶液中的溶解度降低，导致菊苣酸不能被提取出来。 2. 菊苣酸提取条件的优化：
在预试验的基础上，选择提取温度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为因素，各取3个水平，以菊苣酸得率为指标，采用L9(34)正交试验优选，结果见表1、2：
由此可见，紫锥菊提取菊苣酸的最佳组合条件为A3B3C2D3：即温度为90℃、溶剂用量为15倍、提取3次、每次2 h。
按照正交试验得到的最优提取条件，进行3次重复试验，紫锥菊提取物中菊苣酸的质量分数为4. 1%，菊苣酸提取得率为1. 12%。 （三）紫锥菊提取物的树脂法纯化：
紫锥菊提取液浓缩至原来的1/10→回收乙醇→作为大孔吸附树脂的工作液。通过对AB-8、S-8、H103、NKA-9、X-5、D4020、D3520、NKA-2、D4006大孔吸附树脂进行静态吸附试验，发现AB-8树脂对菊苣酸的饱和吸附容量最高，达56.36mg/g湿树脂。
在解吸试验中，AB-8树脂吸附饱和后，依次用水及10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液进行洗脱，收集各部分洗脱液。HPLC分析结果表明，水及10%乙醇洗脱液中没有菊苣酸洗脱下来， 30%、50%乙醇洗脱液中含有菊苣酸，而70%、90%乙醇溶液中不含菊苣酸。 故树脂吸附饱和后，先用水洗脱至无色，再用50%乙醇洗脱，即可得菊苣酸粗品。 在静态吸附研究的基础上，上AB-8树脂玻璃柱(自制，15 cm×2 cm，树脂床体积为30mL)进行动态穿透试验。上柱液中菊苣酸质量浓度为3. 30mg /mL，以2BV/h连续上柱，自动部分收集流出液，采用HPLC法测定菊苣酸含量，得到AB-8树脂泄漏曲线，见图2：
可见30mL AB-8树脂可处理6BV(180mL)的物料液量而基本不发生泄漏。此时树脂床共吸附菊苣酸594mg (6×30×3. 30)，湿态AB-8树脂对菊苣酸的工作吸附量(泄漏前吸附量)可达19. 8mg /mL，达到饱和时可处理14BV (420mL)，饱和吸附量可达46. 2mg /mL。
取120mL含菊苣酸3. 0mg /mL水溶液→上装柱体积为30mL的AB-8树脂柱→上柱完成后→用去离子水把树脂柱洗至无色→后用50%乙醇溶液洗脱→自动部分收集器收集洗脱液→采用HPLC法测定菊苣酸含量→得到AB-8树脂的解吸曲线(图3)：
可见用50%乙醇溶液洗脱,当洗脱液体积达到150mL时，即为床体积的5倍时，基本上能把吸附的菊苣酸洗脱完全。洗脱液用旋转蒸发器浓缩，得到1. 43 g黄色粉末，HPLC测定纯度为24. 22%，洗脱率为96. 21%。 （四）醋酸乙酯的萃取纯化：
取AB-8树脂处理得到的粉末溶于10倍体积水中→用6mol/LHCl调节至pH 3→水溶液分
别用醋酸乙酯、正丁醇、异戊醇进行萃取→醋酸乙酯萃取液直接减压浓缩。 正丁醇、异戊醇因沸点较高，回收有一定的困难，因而萃取液先用5% NaOH调节至pH 6. 5→后加水反萃→分取水层→减压浓缩得粉末。结果所得
产品中菊苣酸的质量分数分别为69. 28%、32. 52%、46. 30%，因此醋酸乙酯萃取效果最好，得到的产品纯度最高，选用醋酸乙酯进行萃取。
溶液的pH值对醋酸乙酯萃取的影响的结果见表3。
pH为2～3时，紫锥菊提取中的菊苣酸萃取效果较好，萃取率高，产品纯度高。
这是由于当pH≤3时，菊苣酸由原来的菊苣酸盐变为游离态，从而改变了菊苣酸在水相和有机相中的分配率，因此用醋酸乙酯能很好地把它从水相中萃取出来。
而当溶液的pH 3时，用等体积的醋酸乙酯分别萃取1～4次，紫锥菊提取中菊苣酸的萃取率分别为41. 40%、63. 43%、80. 51%、96. 83%。即醋酸乙酯萃取4次可以基本萃取完全。 （五）紫锥菊提取菊苣酸产品的检测：
经40%乙醇提取、AB-8树脂吸附、50%乙醇洗脱、醋酸乙酯萃取最终得到产品为浅黄色粉末，纯度达69%以上。
三、西安源森生物实验室紫锥菊提取纯化菊苣酸实验结论
由以上实验可以得出紫锥菊提取物中菊苣酸成分的提取纯化最佳工艺为：
取一定量的紫锥菊根粉末→用15倍的40%乙醇溶液于90℃下加热回流提取3次→每次为2h→合并滤液→浓缩至原液体积的1/10→回收乙醇→滤过→得到的水溶液以2BV /h的流速上柱床体积(BV)为30mL的AB-8树脂柱→吸附完成后→用去离子水洗至流出液无色→再用50%乙醇溶液洗脱→乙醇洗脱液浓缩蒸干→可得到菊苣酸粗品。
粗品溶于水→用6mol/L盐酸调pH3→,醋酸乙酯萃取4次→萃取液浓缩蒸干即得产品。 因此利用乙醇水溶液提取、AB-8树脂吸附、醋酸乙酯萃取的方法从紫锥菊根中提取纯化菊苣酸是可行的。该工艺操作简单、方便、成本低、菊苣酸产品纯度高，适合用于工业化生产。
紫锥菊是目前受到国际普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂，紫锥菊提取物及其保健品等制剂销售额居美国医药市场销售排名前5名。因此低成本、高品质菊苣酸的提取纯化工艺的应用具有极大的发展前景和市场空间