微生物质控考核菌种的鉴定
常州市疾病预防控制中心 杜强 徐晓怡 王小萍等
菌种鉴定是疾病预防控制中心实验室常见的考核方式之一。它不但证明了该实验室有能力进行规定类型的检测和（或）校准，而且对于该实验室管理和技术的提高也具有十分重要的促进作用。本中心于今年8月份接受了省疾控的微生物质控考核并获得了较好的成绩，现将情况简述如下。
1 材料和方法
1．1 考核材料：一支带有未知致病菌的肛拭子。
1．2 考核要求：假设此肛拭子是来源于一腹泻病人，要求从中检出一至数种致病菌，提示可能菌种范围限定于申报的数种腹泻致病菌。时间要求3天。
1．3 检验试剂： 本次检测培养基为宜兴万石培养基厂产品，微量生化管由浙江省军区后勤卫生防疫检验所提供，沙门菌诊断血清（56种）由成都生物制品研究所提供，志贺菌诊断血清（50种）和出血性大肠杆菌O157由兰州生物制品研究所提供，均在有效期内。 1．4 检验依据：GB/T 4789-2003食品卫生国家标准、《食品卫生检验方法注解（微生物部分）》（孟昭赫）
2 检验步骤及结果判断
2．1 确定检测目标：首先根据检测要求，确定可能的菌种有沙门氏菌、 志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、致病性大肠埃希氏菌共7种。 2．2 增菌及平板划线分离：无菌操作，取肛拭子接种于营养肉汤内，37℃培养24h后 分别划线接种于以下各类选择性平板：
两块SS平板（编号为1-A和1-B）， 37℃，培养24h； 两块血平板（编号为2-A和2-B）， 37℃，培养24h。 两块氯化钠蔗糖平板（编号为3-A和3-B）， 37℃，培养24h。
两块4号琼脂平板（编号为4-A和4-B）， 37℃，培养24h。
2．3 平板生长情况： 两块SS平板（编号为1-A和1-B）上有三类菌落，一类为无色半透明，中等大小，圆整润滑，中心黑色的菌落生长（编号为A），一类为中等大小，略微泛红，湿润，光滑的菌落（编号为B）。一类为较小，扁平，生长不良，有粘性但不易挑起的菌落（编号为C）。革兰氏染色均为阴性无芽胞杆菌。
两块血平板（编号为2-A和2-B）上菌落较多且杂，很难区分，但可观察到没有金黄
色葡萄球菌和溶血性链球菌的明显典型的菌落，及其两者较典型的溶血现象。
两块氯化钠蔗糖平板（编号为3-A和3-B）上有一类菌落，为中等大小，不透明，光
滑，湿润的菌落，因不发酵蔗糖而呈绿色（编号为D）。革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，悬滴法镜检运动活泼，
两块4号琼脂平板（编号为4-A和4-B）上无菌落生长。 2．4．生化鉴定：
2．4．1 A号菌株，因产H2S，初步怀疑为沙门菌，进行进一步的的生化反应。结果见表1。
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表1 A号菌株生化检测项目结果 生化项目 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 木糖 阿拉伯糖 蔗糖 甘露糖 鼠李糖 棉子糖 ONPG 甘露醇 结果 ＋ － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ + 生化项目 肌醇 侧金盏花醇 卫矛醇 山梨醇 葡萄糖铵 甲基红 VP 靛基质 西蒙氏枸椽酸盐 水杨素 覃糖 结果 － － － ＋ － ＋ － － ＋ － ＋ 生化项目 赖氨酸脱羧酶 精氨酸水解酶 鸟氨酸脱羧酶 尿素 KCN 丙二酸钠 明胶 七叶苷 硝酸盐还原 苯丙氨酸 动力 结果 － ＋ － ＋ ＋ － － － ＋ － + 根据生化反应结果，不符合沙门氏菌的生化反应定义，且血清凝集实验也为不典型的弱阳性，查对生化反应结果，最后确定为条件致病菌弗劳地枸椽酸杆菌［1］。
2．4．2 B号菌株，因在SS上略微泛红，初步怀疑为致病性大肠埃希氏菌，进行进一步的生化反应。结果见表2。
表2 B号菌株生化检测项目结果
生化项目 氧化酶 动力 靛基质 尿素 硫化氢 甲基红 VP 乳糖 动力 结果 - + + - - + - + + 生化项目 阿拉伯糖 谷氨酸 赖氨酸脱羧酶 精氨酸水解酶 鸟氨酸脱羧酶 木糖 水杨素 葡萄糖 麝香草酚兰抑制 结果 + - + - + + - + ＋ 生化项目 明胶 侧金盏花醇 苯丙氨酸 硝酸盐还原 西蒙氏枸椽酸盐 七叶苷 KCN 甘露糖 结果 - - - + - - - + 根据生化反应结果，符合出血性大肠杆菌O157：H7的生化反应定义，血清凝集实验结果强阳性。最后确定为出血性大肠杆菌O157：H7［2］
2．4．3 C号菌株和D 号菌株，因C号菌株生长不良，有粘性但不易挑起，符合副溶血性弧菌在SS上的生长特征。而D号菌株带有典型的副溶血性弧菌特征。所以怀疑C号菌株和D号菌株是同一种菌，即副溶血性弧菌。
C号菌种和D 号菌株，进行盐浓度曲线实验，结果0％NaCl、11％NaCl肉汤中不生
长、3％NaCl、7％NaCl肉汤中生长，符合副溶血性弧菌定义，进行进一步生化反应，结果见表3（注：以下微量生化管均为嗜盐菌专用）：
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表3 C号菌株和D 号菌株手工生化检测项目结果
生化项目 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 木糖 阿拉伯糖 蔗糖 覃糖 鼠李糖 棉子糖 甘露醇 结果 ＋ － ＋ - ＋ － ＋ - － + 生化项目 肌醇 侧金盏花醇 卫矛醇 山梨醇 西蒙氏枸椽酸盐 甲基红 VP 靛基质 水杨素 动力 结果 － － － - ＋ ＋ － + － + 生化项目 赖氨酸脱羧酶 精氨酸水解酶 鸟氨酸脱羧酶 尿素 硝酸盐还原 丙二酸钠 明胶 七叶苷 苯丙氨酸 结果 － - + - ＋ － + － － C号菌株和D 号菌株生化反应结果完全相同，且符合副溶血性弧菌生化反应定义。因此最后确定为副溶血性弧菌。
3．0 结论与体会：
3．0．1 此次样品中共检出三种致病菌，分别是：出血性大肠杆菌、副溶血性弧菌和条件致病菌弗劳地枸椽酸杆菌。但因考核要求是腹泻致病菌，所以去除了条件致病菌弗劳地枸椽酸杆菌。上报后得到了满分评价。
3．0．2 此次菌种鉴定考核，采用的是混合菌株，和通常的单菌株考核相比，难度增大。因此菌种的分离纯化显得尤为重要。首先应根据考核要求选用具有较好选择性培养基。其次应抓住一些菌独有的生长特征进行相应的生化反应，这样不仅可以减少盲目性和工作量，而且能提前作出正确的判断。
3．0．3 在鉴定过程中，最忌的是根据一两种特殊反应就过早作出先入为主的判断。如这次鉴定考核中，出现了近来考核中比较流行的弗劳地枸椽酸杆菌［3］。此菌因在SS平板上H2S呈阳性且易与沙门氏血清凝聚实验产生交叉反应，因此容易与沙门氏菌混淆。如遇这种情况，完备的生化反应就显得相当重要。此外，这次鉴定考核中所使用的血琼脂平板虽然选择性不强，在分离选择上效果不佳，但可用于菌种溶血性的鉴定，也是比较重要的。
参 考 文 献
［1］ 何晓青主编，卫生防疫细菌检验，人民卫生出版社，1990
［2］ 郭玲，李冶悦，李国兰等，O157：H7大肠杆菌的调查及检验方法研究，中国卫生
检验杂志2000，10（5）：550-552。 ［3］ 曹玉芹，崔西超，彭武梅，室内细菌鉴定质控报告，中国卫生检验杂志2002，12（5）：559-560。
2005年8月28日
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