枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化
采用改进的Spizizen法进行，详述如下： A，试剂
SPI-A Salts Solution：
0.4% 硫酸铵（NH4）2SO4 132 2.8% K2HPO4·3H2O 228 1.2% KH2PO4 136
0.2% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠 210
121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）
SPI-B Salts Solution：0.04%MgSO4*7H2O 120
121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）
100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物） 10% Yeast Extract
121° 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）
100×EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至8.0) SPI Medium（20ml） 9.8 ml SPI-A Salts Solution 9.8 ml SPI-B Salts Solution 200ul 50% Glucose（0.1g） 200ul 100× CAYE solution SPII Medium（6 ml） 5.88ml SPI Medium 60ul 50mM CaCl2 60ul 250mM MgCl2 注：SPI、SPII 量比较少，容易干，确保大肠转化成功再配。
B 感受态细胞的制备和转化
1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜 2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37°100rpm 1.5h
3. 加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm 10min， 用1.5ml离心管分装成500ul每管 4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm 30min 5. 将离心管转移到250rpm，37°，1.5h
6. 以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37°过夜。
离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。 感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用 大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）
枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
（1）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体LB培养基中，37℃过夜培养
（2）取100ul过夜培养物，接种于5 ml SPI培养基中，37℃，200rpm震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII培养基， 37℃，100rpm震荡培养，培养1.5h （3）加入20ul100×EGTA溶液，37℃，100r/min震荡10min（分500ul/管） （4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37℃，100r/min，震荡30min。 （5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h
（6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应 抗生素的LB平板上，过夜培养
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的）
1. 2. 3. 4.
LB平板上，37℃过夜培养
挑单菌落，接种于5 ml GM Ⅰ溶液，30℃ 125rpm，摇床过夜培养 次日，取2ml转接到18ml GM Ⅰ中，37℃， 250rpm， 3.5h
再取10mL上一步骤的培养液转接到90mL GM Ⅱ中，37℃，125rpm，
1.5h， 5000rpm 10min 5. 用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受态细胞 6. 加30% 的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管） 10×最低盐溶液（100mL） K2HPO4 14g KH2PO4 6g （NH4）2SO4 2g
Na3C6H5O7·2H2O 1g（二水合柠檬酸三钠） MgSO4·7H2O 0.2g
氨基酸溶液 2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹 GMⅠ 1×最低盐溶液 95mL 50% 葡萄糖 1mL 5% 水解酪蛋白 0.4ml 10% 酵母汁 1mL 2mg/mL 氨基酸溶液 2.5ml GM Ⅱ 1×最低盐溶液 97.5mL 50% 葡萄糖 1mL 5% 水解酪蛋白 0.08ml 10% 酵母汁 0.04mL 0.5M MgCl2 0.5mL 0.1M CaCl2 0.5ml 2mg/mL 氨基酸溶液 0.5ml
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法
1. 挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°过夜培养；接种量1%至growth medium（LB含有0.5M山梨醇），37°培养至OD600nm为0.85-0.95；
2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4℃，5000rpm 离心5min；用冰冷的EM（electroporation medium, 0.5M 山梨醇；0.5M甘露醇 36.434g；10%甘油），洗四次，将培养液中的成分全部去除；
3.将沉淀悬于1/40体积冰冷的EM中，使细胞终浓度为1-1.3×1010cfu/ul，即得到感受态细胞（无需液氮处理，可直接存储于-70℃）
4.将80ul感受态细胞与1ul整合质粒（浓度1-5ug/ul），以不加质粒的感受态细胞作为阴性对照。
5.转至预冷的电转杯中，冰上放置5min 6. 1mm电转化杯，采用2000v/mm，4.5-5.9ms电击；2mm电转杯，采用2500V/mm，4.0-5.9ms电击一次
7.立即加入500ul Recovery medium(LB含有 0.5M山梨醇，0.38M甘露醇) 8.转移至无菌的1.5ml离心管中，37℃，100rpm，预培养3h 9.将培养液涂布在含相应抗性抗生素的LB平板上，正面放2h后，带转化液被培养基完全吸收后，倒置培养。
挑单菌落，提质粒验证。加溶菌酶