直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 操作：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC) 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)上机测样 报告结果 报告百分数 参考值
IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88% 临床意义
自身溶血性贫血的分型诊断
粒细胞抗体测定
原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析 1) 溶血
2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC) 3)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。 4)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心 5)上机测样 报告结果 报告百分数 参考值
IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4%
临床意义
白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性
白血病免疫分型测定
原理：
三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管 标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。 抗凝剂 肝素抗凝 要求 1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3． 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用
PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。 操作-样本制备： 细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。 2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配) 4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。 5．溶血：
细胞浆和核抗原
1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
2．首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。 3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。 4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min) 6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。 8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。 9．300g离心5分钟后，弃去上清液。 10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。 11．上机测样
报告结果：报告百分数 参考值
CD34+<5% MPO+<5% 粒系<20% 淋系<30% 临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
原理：
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC 操作： 细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C02 37℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。 流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞； ●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； ●B门内TH细胞亚群分布： 1区数值---Th 1细胞 (%)
4区数值---Th 2细胞 (%) 2区数值---Th 0细胞 (%) 报告结果 ： 报告百分数 正常参考值
Thl(IFN-γ)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44% ThO ：0.51±0.26% 临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力
非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。