生物核磁共振技术在结构生物中的应用
——《化学生物学讲座课程论文》
核磁共振技术在化学生物学中的应用
摘要 波谱学（Spectroscopy）已全然改变了物理学、化学、生物学、药学和生物医学等科学家的研究工作，波谱技术成为研究大自然分子内部秘密的最可靠、最有效的手段。
过去68年（1945-2013），核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）是最广泛地用于研究分子性质的波谱技术，它可从分子的三维结构到分子动力学、化学平衡、化学反应、超分子、有机化学、无机化学、物理化学、分析化学、材料科学、药物化学、医学、生物化学[1]、分子生物学、细胞生物学、遗传学、信号传导等各个领域进行应用。NMR是研究物质微观和宏观结构以及相互作用的强有力技术手段，在物理、化学、生命科学、生物医药科学、材料科学、海洋科学和环境科学等学科领域的研究中发挥着越来越重要的作用[2]。 关键词 核磁共振技术；诺贝尔奖；蛋白质；多肽；结构；应用
核磁共振技术是20世纪40年代发展起来的一项新的分析技术。利用核磁共振技术可以在不破坏样品的情况下确定物质的化学结构及某种成分的密度分布，其应用已迅速扩展到物理、化学领域之外的医疗、生物工程等方面。成为分析生物大分子复杂结构和诊断病情最强有力的方法之一。
NMR的基本原理是利用一定频率的电磁波照射处于磁场中的原子核，原子核在电磁波作用下发生磁共振，吸收电磁波的能量，随后又发射电磁波，即发出磁共振信号。由于不同原子核吸收和发散电磁波的频率不同，且此频率与核环境有关，故可以根据磁共振信号来分析物质的机构成分及其密度分布。 一． 结构生物学中的核磁共振技术 1、 蛋白质结构的重要性
蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构，作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸链接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰，有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为，若残基数少于40，就陈志伟多肽或肽。要发挥生物学功能，蛋白质需要正确折叠为一个特定构型，主要是通过大量的非共价相互作用（如氢键，离子键，范德华力和疏水作用）来实现；此外，在一些蛋白质（特别是分泌性蛋白质）的折叠中，二硫键也起到关键作用。一定数量的残基对于发挥某一生物化学功能是必要的；40-50个残基通常是一个功能性结构域大小的下限。蛋白质大小的范围可以从这样一个下限一直到数千个残基[3]。
不言而喻，蛋白质在人类正常的生理活动中起到非常重要的作用。比如人体在进行有氧呼吸是需要氧气，而氧气是通过红细胞的血红蛋白提供的；催化细胞中的有机反应的酶绝大多数属于蛋白质。而我们的皮肤、我们的头发全部都是蛋白质，我们的生活离不开蛋白质，这样就凸显出了蛋白质结构的重要性。蛋白质的功能由蛋白质的结构决定，人体中任何细胞的每一项活动都需要不同功能的蛋白质来完成，因此，测定蛋白质的结构显得更加重要。目前为止测定蛋白质的机构主要有三种方法，一是X射线晶
2、
体衍射技术，这项技术的优点是所能测定的生物大分子的分子量范围很宽，1-400kDa，且这项技术很成熟，应用成本比较低廉。缺点是我们需要制备出适合X射线衍射的单晶体才能测定[4]。二是多维核磁的共振技术[5]。这项技术的有点是用动态的溶液结构可研究动力学，更接近于生理状态，不需要预先制备晶体。与X射线晶体衍射技术相对，这项技术的缺点是应用成本比较高，测定速度慢，只适用于分子量小鱼30KDa的可溶性蛋白，并且需要用同位素标记来测定。第三种技术是低温电子显微镜的三维电子衍射图像重构技术。这种技术的优点是可以测定分子量非常大的生物大分子的复合体，如病毒、膜蛋白的复合体等等，但与多位核磁共振技术相比较，这种方法才刚刚兴起，有待发展，且对蛋白质的分辨率较低，不易识别[6]。
核磁共振技术
当电子处于外加磁场中，能级发生分裂。公式
很好地为我
们做了解释。其中h为普朗克常数，v为外加频率。γ为磁旋比。当分子的尺寸接近于普朗克常数时，无需考虑量子力学效应。当外加频率满足v=γB0/2π时，原子核能够吸收频射能量使得电子从低能级跃迁到高能级。NMR的参数有三个，分别是化学位移δ，它决定的是谱线的位置；标量耦合常数J（Hz），它决定的是谱线的分布图案和峰间距；横向驰豫时间T2（s），它决定谱线的半高宽[7]。而对于核磁共振衍射峰峰谱，并且告诉我们，若测量的质子有n个，那么久会出现n+1个峰，并且我们发现了，驰豫时间越短，谱就越宽。而在高能级的质子与周围的晶格发生反应使其放出能量，质子此时由高能级跃迁到低能级。而对于MRI的核磁共振图像而言，我们发现：
（1）用2D1H-1HNMR测定多肽和蛋白质结构时，只能测定分子量小于等于10KDaDE 多肽和蛋白质结构，在测定分子量大于10kDa的时候遇到苦难，驰豫时间短，自旋体系很难被识别[8]。 （2）用3D/4D异核NMR谱测定蛋白质溶液结构式，可以利用化学位移分布范围较宽的异核来减少谱峰的重叠。比如15N和13C的分布范围就比较广，分别是从100~140nm;0~200ppm.利用较大的异核丁耦合来实现高效率的核磁化转移，能测定的蛋白质大小可达几十KDa。分子量越大，峰越宽。多肽和蛋白质溶液的测定方法有以下几种：样品制备；记录核磁共振谱；谱峰归属；确定二级结构单元；约束条件的建立和从NMR数据到分子模型。
二、用同核二维NMR技术测定多肽的溶液结构[9] 对于两栖类树蛙神经毒素多肽，经过细致的调查研究，发现两栖类动物的皮肤对其生存起着重要的作用。我可以提出两个问题，1.anntoxin的三维特征是什么？核磁共振得到的分子结构式是一组β平行折叠的大分子物质。2. 2.anntoxin和conkunitzin-S1的结构差别在哪里？比较结果如图所示。
第二种多肽是两栖类无指盘臭蛙的凝集素多肽。凝集素是能识别糖蛋白结构的碳水化合物，体内转移地结合于肝和肺，无毒性，免疫原性极低，可以用作药物靶向载体。由此我提出了两个问题：1.为什么这种多肽结构会这么稳定？凝集素多肽中有三条氢键，所以结构很稳定。2.
odorranalectin结合L-fucose 的分子机制指的是什么？是指热相对运动过程中谱峰会移动，用小分子以太可以将不参与位点结合的位置将其与氨基酸结合。第三种多肽是滇蛙的皮肤抗氧化性多肽。滇蛙的皮肤抗氧化系统可以分为两类。第一类是低分子量的抗氧化酶，第二类包括很多化合物，他们通过清除活性氧族来抵抗氧化。第四种多肽是双团棘胸蛙抗菌肽。这种多肽通过破坏细胞膜发挥抗菌功能。第五类是蛇肽抗菌，是一种优秀的临床抗生物药物，由30个氨基酸组成。
三、用异核多维NMR技术测定蛋白质溶液结构 蛋白质在溶液中的三维空间结构、动力学与蛋白质生物功能的关系是在分子水平上理解生命现象的重要基础[10]。NMR技术在研究蛋白质动力学方面具有独特的优势，所能表征的运动过程相关时间尺度很广[11]。蛋白质在溶液中的三维空间结构、动力学与蛋白质生物功能的关系是在分子水平上理解生命现象的重要基础。许多生物过程是通过蛋白质构想变化传递信息来完成的。一方面，蛋白质分子需要足够的刚性以识别特定的底物；另一方面，它也需要足够的局部柔性以诱导底物的结合。因此，蛋白质动力学性质对蛋白质生物功能起着十分重要的作用。
异核多维NMR核自旋弛豫方法研究蛋白质动力学的步骤[12]是:1)通过异核(2H、13C、15N)实验室坐标系自旋弛豫实验获得异核的R1、R2、NOE值;2)根据弛豫理论建立R1、R2、NOE与谱密度函数的关系;3)利用约化谱密度函数或Model2Free方法建立谱密度函数与描述蛋白质动力学的参数的关系;4)初步估算分子整体运动相关时间或各向异性扩散系数,进行Model2Free参数选择,利用最小二乘法拟合得到动力学参数.本文介绍了实验室坐标系异核多维NMR技术研究蛋白质动力学的实验技术、理论
表述、Model2Free方法和应用实例以及NMR技术研究蛋白质动力学的展望。
四、诺贝尔奖与核磁共振技术[13] 从诺贝尔授奖情况看，NMR科学研究领域及其衍生的技术横跨了80年、三个学科的六次诺贝尔科学奖，开创了科学史（特别是诺贝尔科学奖授奖史）的记录，也表明了NMR科学研究领域及其衍生技术的重要性。
六次与NMR相关的诺贝尔奖分别为
1. The Nobel Prize in Physics 1943, O. Stern, USA – Discovery of magnetic moment of proton
2. The Nobel Prize in Physics 1944, I. Rabi, USA –
Discovery of resonance method for recording the magnetic properties of atomic nuclei
3. The Nobel Prize in Physics 1952, E. M. Purcell ＆ F. Bloch, USA – Discovery of new methods for nuclear magnetic precision measurement 4. The Nobel Prize in Chemistry 1991 – Richard Robert Ernst, Swiss– Development of Fourier Transform NMR spectroscopy (FT-NMR) 5. The Nobel Prize in Chemistry 2002 – Kurt Wuthrich, Switzerland – Determining 3-D Structure by NMR （Bio-NMR）
6. The Nobel Prize in Medicine 2003 – Paul C. Lauterbur, USA- ＆ Peter Mans field, U.K. Discoveries concerning magneitc resonance image (MRI；
1943年诺贝尔物理学奖获得者德国物理学家施特恩发展了分子束方法，并用于发现质子磁矩，测量了多种核磁矩；1944年诺贝尔物理学奖获得者拉比发展了斯特恩的分子束法，建立了分子束磁共振方法，对核磁矩进行了精确测量；1952年诺贝尔物理学奖获得者珀赛尔和布洛赫发展了磁共振的精密测量新方法，发现了核磁共振现象；1991年诺贝尔化学奖由瑞士物理化学家恩斯特获得，他发现了NMR的原理、方法和技术等，运用FT-NMR谱仪实现了多维的NMR技术；2002年的诺贝尔化学奖授予了瑞士化学家维特里希获得，他的贡献在于利用了核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法；美国化学家劳特布尔与英国物理学家曼斯斐尔爵士在2003年共同摘得了诺贝尔医学奖，他们发展了磁共振成像技术，为医疗检测与医学诊断带来一场新的革命，大大推动和深化NMR在临床医学上的应用，并带来巨大的商业价值与MRI成像仪市场。
参考文献
[1]Gerard S. Harbison, Judith Herzeld, and Robert G.Griffin, Solid-State Nitrogen-15 Nuclear Magnetic Resonance Study of the Schiff Base in Bacteria, Biochemistry, Volume 22, Number 1, January 4, 1983
[2] 高明珠. 核磁共振技术及其应用进展. 1009-5624- ( 2011) 03-0048-04 [3]摘自百度百科
http://baike.http://www.wodefanwen.com//link?url=CyLWeai7khBQGHJLMJ7brTFuao4B0eE32vKTw7gwIhrrIRPWCFN-0_3EV4lRi9iE
[4] 杨新萍. X射线衍射技术的发展和应用. 1009-4490( 2007) 01-0072-05
[5] Craik D J , Wilce J A. Studies of protein2ligand interactions by NMR. In“rotein NMR Techniques”( Ed. : Reid DG) [M] . New J ersey : Humana Press Inc , 1997.
1952232.
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[7] Lian L Y , Barsukov I L , Sutcliffe MJ , et al . Protein2ligand interactions : exchange processes and determination of ligand conformation and protein2ligand contact s [J ] . Met hod Enzymol , 1994 , 239 : 6572699.
[8]Chen,Y.;Reizer,J.;Saier,M.H.;Jr.;Fairbrother,W.J.;andWright,P.E..(1993)Biochemistry 32,32-37
[9] 林东海,洪晶. 用NMR技术研究蛋白质-配体相互作用[J]. 波谱学杂志,2005,(3). [10] Güntert P , Mument haler C , Wüthrich K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with new program DYANA [J ] . J Mol Biol , 1997 , 273 : 2832298.
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[12] Fesik S W, Neri P , Meadows R , et al . A model of the cyclophilin/ cyclosporin A (CSA) complex from NMR and X-ray data suggests that CSA binds as a transition2state analog [J ] . J Am Chem Soc , 1992 , 114 : 3 16523 166. [13] 姜广智, 核磁共振与诺贝尔奖