PCR扩增过程中常见的问题及解决方法
PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究用应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。 一、 假阳性扩增
在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手：
⒈ 试剂污染：
厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 ⒉ 实验室污染：
这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 ⒊ 采样污染：
在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。 二、 假阴性扩增：
如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因： ⒈ 仪器故障：
出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴性其它原因的基础，仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出
现假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 ⒉ 试剂失效或无效：
了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。
⒊ 试剂的敏感度：
有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重提一下：目前经常碰到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用抽象的阳性率应该是60％或20％这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR结果”，这是因为“二对半”与“PCR”是两种完全不同的检测方法，其检测结果的意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试剂，国内的“二对半”试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在50％以下，怎么可能作为质量评定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。 三、 扩增产物拖尾
有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关： ⒈ 扩增系统不完善：
这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。 ⒉ 模板处理方法不完善：
PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。 ⒊ 引物设计不合理：
引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个BP组成；其次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC碱基含量应在45-55％左右；第四，两个引物在3′未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源
性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。
四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1-0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。
引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的DNA序列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的DNA序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。 病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。
PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。
PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）