常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0030-2003
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水质 总大肠菌群测定作业指导书
1 含义及执行标准 1.1
含义
总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 1.2
方法原理
多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。 1.3
水环境质量标准
表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标 （GB/T 14848-93） 类 别 标准值（个/L） Ⅰ类 ≤3.0 Ⅱ类 ≤3.0 Ⅲ类 ≤3.0 Ⅳ类 ≤100 Ⅴ类 ＞100 表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准 （GB 5749-2006） 类 别 标准值（个/L） 饮用水（MPN/100mL或CFU/100mL） 不得检出 表1-3 总大肠菌群渔业水质标准 （GB 11607-89）
类 别 标准值（个/L） 1.4
水污染物排放标准
表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准 （GB 3552-83）
类 别 标准值（个/L） 内河 ≤2500 沿海（距最近陆地4海里以内） ≤2500 沿海（距最近陆地 4～12海里） ≤10000 贝类养殖 ≤500 一般渔业用水 ≤5000 表1-5 总大肠菌群肉类加工工业水污染物排放标准 （GB 13457-92） 禽类屠宰加工、畜类屠宰加工、肉制品加工 类 别 一级 标准值（个/L） 2 分析方法 2.1
方法名称、方法来源及适用范围
≤2500 二级 ≤2500 三级 ≤10000 1
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方法名称：多管发酵法
方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局 2002年 第五篇 第二章 五(一)
方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。 2.2
仪器
高压蒸汽灭菌器 电热干燥箱 恒温培养箱 显微镜 冰箱
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。 2.3 标准菌株制备
将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4 培养基
2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。 2.5 分析步骤 2.5.1 生活饮用水
①初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱培养24h。
②平板分离：经初发酵试验培养24h后，发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为
2
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产气。将产酸产气及只产酸发酵管，分别用接种环划线接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱内培养18～24h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落；伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 ③复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱内培养24h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群菌存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管数查表6，报告每升水样中的大肠菌群数。 2.5.2 水源水
①将水样作1：10稀释。
②于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加10ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml1:10稀释的水样。共计15管，三个稀释度，将各管充分混匀，置于37℃恒温箱培养24h。
③平板分离和复发酵试验的检验步骤同（1）“生活饮用水”检验方法。
④根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表7，即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。 2.5.3 地表水和废水
①地表水中较清洁水的初发酵试验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应作1：10，1：100；1：1000或更高的稀释，检验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。
②如果接种的水样量不是10ml，1ml和0.1ml，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面的公式换算成每1L的MPN值，即为1L水样中的总大肠菌群数。
MPN值?
MPN指数 ?2第一个浓度的接种量?103
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表6 大肠菌群检数表
（接种水样100ml2份，10ml10份，总量300ml）
10ml水量的阳性管
数
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
100ml水量的阳性瓶数
0
1L水样中大肠菌群数
＜3 3 7 11 14 18 22 27 31 36 40
表7 最可能数（MPN）表
（接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时，不同阳性及阴性情况下100ml
水样中细菌数的最可能数和95%可信限值） 出现阳性份数 每100ml水样中细10ml管 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 1ml管 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 0.1ml管 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 菌数的最可能数 ＜2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 1 1 7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 5 5 5 5 5 5 5 下限 上限 10ml管 4 4 4 4 5 1ml管 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 0.1ml管 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 95%置信限值 出现阳性份数 每100ml水样中细菌数的最可能数 26 27 33 34 23 34 43 33 46 63 49 70 9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 78 80 93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 下限 95%置信限值 上限 1
1L水样中大肠菌群数
4 8 13 18 24 30 36 43 51 60 69
2
1L水样中大肠菌群数
11 18 27 38 52 70 92 120 161 230 ＞230
4
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2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4
1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 1 2 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 0 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 21 26 22 2 2 3 1 2 2 4 4 5 5 3 5 5 7 9 7 21 21 28 19 25 25 34 34 46 46 31 46 46 63 78 67 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600 ≥2400 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640 220 190 250 310 500 300 190 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800 3 质量控制要求 3.1 对照控制
采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。 3.2 精确度
同一实验人员所作前15个阳性水样平行双样结果为X1i、X2i（X1i、X2i＞0，i＝1，2，?，15），则精确度判断值＝3.27?R。
?logX1i?logX2i ）
i?1当分析所得R?logX1?logX2＞3.27?R表示精密度已失控；否则平行双样的差
距可以接受。 4 数据处理 4.1 数据审核
分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。 4.2 数据填报
总大肠菌群报告以个/L单位填报，当数量在100以内按实有数据报告；大于100采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用
5
（ R ? ( ? R i ) /15，Ri15常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0030-2003
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10的指数形式表示（如报告16，000或1.6×104）。 5 样品采集
5.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；
5.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；
5.3样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液；
5.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采； 5.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；
5.6 采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。 6 期间核查 6.1 人员素质
首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。 6.2 仪器设备
臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。 7 分析环境条件控制 7.1 仪器设备
保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。 7.2 无菌室
定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足。
7.3 分析环境条件检查和记录
每次分析样品时，作无菌室空气细菌培养对照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。
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