一类的生长细胞悬浮在液体培养基内。前一类通常称为机质依赖型或 停泊依赖型培养, 后一类称为悬浮培养。用生物反应器技术进行细胞悬浮培养是当今的研究热点,因为这项技术已成功应用于微生物与哺乳动物细胞的工业化生产。已有一些用转瓶、涡旋罐、空气补给生物反应器等不同类型容器进行昆虫细胞悬浮培养的研究报道。除了悬浮培养外, 昆虫细胞也可固定在高分子机质内或吸附在高分子聚合膜表面。由于昆虫细胞培养系统需氧量很高, 大量输氧操作如搅拌、喷气等都是必需的, 但这些操作产生的水剪切应力, 往往引起细胞的损伤和死亡。这个问题目前已经成为细胞大规模培养的关键性限制因子。大规模培养昆虫细胞时要考虑的因素很多,如生物反应器的设计、氧气转运、剪切应力、细胞密度、培养基组分以及装备成本等。在多数场合,大规模培养昆虫细胞用于生产重组杆状病毒表达外源蛋白, 都是作为间歇工艺流程进行的, 因为所有的细胞都因病毒感染的细胞病理效应(CPE)而引起死亡。用这一方法, 往往可以简单地预测何时去收获感染细胞。迄今, 由于“传代效应”的影响,连续或半连续生产杆状病毒的研究取得的成果有限。昆虫细胞进行悬浮扩大培养时, 细胞的敏感性问题是首先要解决的。搅拌槽生物反应器是当今生物工程领域的主要培养装置, 可以在液体表面通气, 也可以在反应器底部通气, 培养基内需添加甲基纤维素或FluronicRF68 等保护剂。根据昆虫细胞培养特点, 要求搅拌器转动时产生的剪切力小, 混和性能好, 围绕这两项要求, 已开发了不少形式的搅拌器, 迄今为止, 每年仍有不少这方面的论文和专利陆续发表。Sasaki 在搅拌浆上安装疏水性的
聚丙烯膜以实现无泡通气搅拌, 在这种改进的搅拌反应器内, 以灌注方式培养 Sf21 细胞, 其密度可达2×107个/mL , 对数生长期可维持 7 d 以上。Kamem 在 11 L 带有螺旋浆式搅拌器的反应器内培养 Sf9 细胞, 这种搅拌器在低转速和低剪切的前提下, 能获得良好的混合与传质效果。利用此装置, 在表面通气的情况下, 细胞密度可达到5. 5～ 6. 0×106个/mL , 细胞成活率高于 98% ,106个细胞中异源蛋白产量可达 5 Λg。由于相对低的细胞密度与产物浓度已在一定程度上限制了昆虫细胞的培养。目前, 焦点之一是寻找一种细胞培养方法, 既能提高细胞密度又能增加细胞产物, 同时能够降低生产成本。固定化昆虫细胞培养作为一项新技术, 近年来发展很快,A gathos 采用胶原蛋白为基质的微珠来固定化培养蚊子细胞, 密度高达 2×107个/mL。King 采用海藻酸2聚L 2赖氨酸制备微囊来培养昆虫细胞, 细胞密度可达 8×107个/mL。固定化培养的另一有效方法是堆积床, 为贴壁培养方式的一种, 昆虫细胞贴壁生长在颗粒状球上, 并在气升式反应器的降液区形成堆积床, 而升液区则进行通气供氧。堆积床法由于可提高培养表面积, 同时又能保持充足的供氧, 因此有很好的发展前景。
在体外培养昆虫细胞工作中 ,为了保种和长期保存昆虫细胞的活性 ,必须将细胞进行冷冻保存 ,并在需要时进行复苏培养。Knudson 和 Bckley曾指出 ,脊椎动物细胞冻存方法也适用于昆虫细胞的冻存 ,但在冻存和复苏的方法上不尽相同。Spallanzani 在1776 年最早发表了冷处理对细胞生命活动的影响报道。1949 年 ,Polge 等人发现
了甘油对低温贮存的细胞的保护作用。1959 年 ,Lovelock 等人发现了一种新的化学保护剂 ,这就是人们所熟知的二甲亚砜(dimethylsulfoxide ,DMSO) 。但三桥淳指出 ,以甘油作为保护剂来冻存昆虫细胞同样可以取得很好的效果[4]。
离的中肠细胞一般是在细胞 培养瓶或培养板中进行离体培 养,贴壁的组织和细胞更容易培养成功,贴附和伸展因子可诱导细胞的伸展,层粘连蛋白和胶原家族的分子可以促进动物上皮细胞生长和分化,其中I型胶原分子的效果较好(刘芳宁和张彦明,2 0 0 7)0但是,Zhang 等(2 0 0 9)在培养中华蜜蜂中肠细胞时发现I型和I V型胶原蛋白并未对细胞贴壁起促进作用 。S a n c h e z等(2 0 0 4)设计了一种促进中肠细胞贴壁的技术,在两层盖玻片中培养红脂大小蠹中肠细胞,在上面盖玻片的压力(71mg/ 0.8c m2)下促进 细 胞 的 生长,这有利于中肠细胞在离体条件下极性分化的产生,为中肠细胞离体培养技术开启了一个新的思路 。[5]
4 昆虫细胞系的应用 4.1
昆虫细胞系在基础医学研究中的应用
在基础医学方面, 利用昆虫细胞研究虫媒病毒、以及病毒在昆虫细胞中的发育和侵染; 利用昆虫细胞系研究人类疾病基因; 利用昆虫细胞系检测药物, 特别是抗癌药物, 进行毒理学研究; 还有学者应用昆虫细胞系研究昆虫细胞的凋亡和细胞周期调控, 这些研究为进一步探
讨人类细胞凋亡机制及某些疾病治疗提供了实验基础。细胞周期调控备受关注。果蝇的细胞周期蛋白 Cyclin D在胚胎发育的不同时期表达, 而 D 型周期蛋白的表达增高, 可以在许多类型的癌细胞中被检测到, 是细胞癌变的一个重要标记性蛋白。有关细胞周期调控蛋白 CycD在果蝇发育中的调控机制, 为肿瘤细胞突变机制的研究奠定了很好的基础。同时也有助于找出抑制肿瘤细胞分裂的方案。 4.2
基因工程 - 昆虫杆状病毒表达系统
自 1983年 Sm ith等创建了昆虫杆状病毒表达载体系统 ( BaculovirusExpressionV ector System,BEVS ) 以来, 昆虫细胞作为重组病毒的表达载体得到了更快更好的发展。利用病毒昆虫细胞表达系统高效表达人体基因, 获得具有治疗疾病的干扰素等蛋白质、多肽和其他具有生物活性的物质, 并最终利用昆虫细胞系作为生物反应器、生产基因工程药物和疫苗。利用杆状病毒表达系统在 Sf9细胞中表达人纤维介素蛋白 2 (hfgl2) 凝血酶原酶并检测其蛋白活性, 为开发重型肝炎蛋白芯片或 ELISA诊断试剂盒提供阳性对照, 也可用于血清特异性抗体的检测, 更为研究该蛋白体外功能学提供了有利的工具。姚文荣等构建狂犬病毒核蛋白 ( NP) 基因的重组杆状病毒表达载体, 在昆虫细胞中表达具有免疫原性的狂犬病毒核蛋
白, 结果证实该表达产物可以用于狂犬病的检测及诊断。用 RT- PCR 方法扩增兔出血症病毒 (RHDV ) 衣壳蛋白VP60基因, 通过克隆、转化得到重组穿梭载体 Bac- m id-VP60, 用此质粒转染 Sf9细胞, 得
到重组病毒 rAcV - Bac-VP60, 为兔病毒出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。 4.3
昆虫细胞系在杀虫剂研究中的应用
既往在研究杀虫剂药效、毒性作用机制及昆虫抗药性等方面, 主要采用活体昆虫进行相关研究。但活体生物测定需要的周期长, 昆虫对药剂的敏感性受季节、温度以及品系等因素的影响较大, 其结果需要校正。为寻找更好的研究方法, 近年来有部分学者应用昆虫细胞系研究杀虫剂毒性。许名飞等应用美国棉铃虫细胞研究灭多威对该细胞基础代谢热值的影响, 提示应用昆虫细胞可以为药物毒理研究提供参考。也有学者通过八种昆虫离体细胞系对灭多威农药的敏感性进行研究。本课题组利用 MDEC- 07114对灭多威的毒效进行测
定, 并从细胞水平就药物对 MDEC- 07114细胞周期以及超微结构的影响进行研究。昆虫细胞可在严格控制的实验条件下,简化影响因素, 并且细胞生长周期短、耗药极少, 进行毒力测定精度高、重复性好, 可同时进行多个药剂的筛选, 更能满足化学杀虫剂和天然源杀虫剂筛选所需的快速和准确的要求, 为杀虫剂开发研究、药效筛选提供实验基础。目前由于化学杀虫剂引起的抗药性日益严重以及造成的环境污染, 使生物杀虫剂成为国内外害虫防治技术的一个新的发展方向。生物杀虫剂主要包括细菌杀虫剂, 如苏云金杆菌( Bt); 杀虫抗生素, 如 Success, Conserve,Tracer,Spin Tor;真菌杀虫剂, 如白僵菌制剂 Boverin。[6]
参考文献:
1、张佑红, 朱雄伟, 陈燕 .昆虫细胞培养及其应用进展. 武汉化工学院学报.第28卷 . 第3期. 2006年05月
2、李守信, 李长友, 郑桂玲等. 昆虫细胞培养研究进展. 西北农业学报 2005, 14(3): 41～ 48
3、宋德伟 , 马艳, 冯颖. 昆虫细胞工程研究进展. 林业科学研究 2004 ,17(1) :116 ～ 124
4、张寰、张永、安秦启联等. 昆虫细胞系的培养和建立技术 .昆虫学报, Acta Entomologica Sinica , August 2007 , 50(8) : 834 - 839
5、闫玉涛, 贺莉芳,刘晖等. 昆虫细胞培养及应用 医学动物防制， 2010年 8月第 26卷第 8期
6、童丹丹,吴艳蕾,郑桂玲等 .昆虫中肠细胞的离体培养. 环境昆虫学报,May2 01 3,3 5(3):3 9 0-3 9 8