磁珠纯化原理及操作步骤
1 磁珠简介
1979 年，John Ugelstad等成功地制备了一种均匀性和粒度适宜的聚苯乙烯微球。将其磁化并与抗体连接后，即成为一种分离细胞效果极佳的免疫磁珠-Dynabeads。发展到现在，磁珠并不仅仅表面只包被着抗体，它还有可能表面包被着-COOH、oligo-dT、蛋白A和G、链霉亲和素等，这为研究人员提供了多样化的选择。
以Agencourt Ampure Beads为例，如下图所示，磁珠由3部分构成， C部分是聚苯乙烯核心，B部分是磁铁微粒，A部分是由羧基组成的多聚物外壳，。B部分分布的磁铁使磁珠具有独特的超顺磁特性，能保证磁珠只有在磁场中才具有磁性，基于这个特性，磁珠在磁场移走后就很容易重悬且不聚沉。A部分可特异性分离DNA。
磁珠结构图
2 种类
目前，国际上使用较为广泛的磁珠有由Backman Coulter提供的Agencourt Ampure Beads以及Invitrogen提供的Dynalbeads。这些磁珠类型各异，能够特异性分离DNA、RNA、生物素标记的大分子、蛋白质以及细胞。例如，表面包被有-COOH的磁珠能够特异性分离DNA；表面植有oligo-dT的磁珠可以分离mRNA；表面结合有链霉亲和素的磁珠可以吸附生物素标记的生物大分子；表面包被有抗体的磁珠可以特异性结合抗原性物质。现我们实验室使用的主要是Agencourt Ampure Beads以分离纯化DNA，以及InvitrogenDynabeads? M-280 Streptavidin 链霉亲和素磁珠以分离生物素标记的RNA 探针。
3原理
Agencourt Ampure Beads的原理是在一定盐（如NaCl、MgCl2、 CaCl2、KCl、LiCl等）和聚乙二醇（PEG-8000）浓度条件下，DNA可非特异性地结合于表面有-COOH末端的磁珠上。一旦结合，可用70%的乙醇对DNA-磁珠复合物进行彻底清洗，最后用Tris缓冲液将DNA洗脱下来。以PEG作为核酸结合环境的原因是PEG与蛋白有极好的相容性，并且能够通过空间位置排斥效应将DNA聚集于包覆有高分子的磁珠上，这样便可除去样品中其他蛋白之类的杂质。另外，PEG还能增加反应混合物的粘度，使磁珠保持悬浮状态而不沉降。
调整溶液中盐离子强度和PEG的浓度，Agencourt Ampure Beads能够可逆、非特异性结合核酸，例如DNA、RNA、PNA等至其表面。其可逆性结合是指高盐离子强度和高PEG浓度溶液使核酸结合磁珠表面，低盐离子强度洗脱液洗脱磁珠上的核苷酸。其非特异性体现在不同核酸的来源、序列的差异性、DNA片段的大小、抑或不同种类的核酸（DNA、RNA、
DNA类似物）均可以无差异地结合到磁珠上。
4 选择片段大小
DNA片段是在一定的盐离子强度和PEG的浓度下，可逆结合到磁珠表面的；不同盐离子强度和PEG的浓度能够使不同片段大小的DNA结合到磁珠表面。例如，较低的盐离子强度和较低的PEG浓度下，只有较大的片段可以沉淀并吸附到磁珠上，较小的片段仍然留在溶液里；随着盐离子强度和PEG浓度的增加，磁珠所能吸附的DNA片段可以越来越小。所以根据这种特性，可以通过调节溶液中盐离子强度和PEG的浓度来实现不同片段大小DNA分离开来的目的。
之前数据证明：1.0×的磁珠能够回收300bp以上的DNA片段，同时夹带200bp、250bp的片段。300bp以上片段占回收后总DNA片段的95.54%。同样地，1.2×的磁珠能够回收250bp以上的DNA片段，同时夹带150bp、200bp的片段。250bp以上片段占回收后总DNA片段的94.48%。
5 磁珠纯化标准操作流程
（1）取出4℃保存的Ampure Beads，放置30min平衡至室温； （2）Vortex混匀，使磁珠处于悬浊液状态；
（3）用移液器添加适量磁珠至DNA样品中并吹打混匀，室温下静止10min； （4）待10min后，将EP管置于磁力架上，静置3-5min至混合液澄清； （5）小心吸去上清；
（6）加入500μl新鲜配制的70%乙醇，上下颠倒磁力架5-6次，吸去上清； （7）重复上一步操作；
（8）将EP管置于37℃的Thermomixer comfort温浴仪中约10min，至磁珠干裂； （9） 加入适量EB（Elution Buffer），以移液器吹打至磁珠重悬，室温静置5min； （10）然后将EP管置于磁力架上，静置3-5min至溶液澄清； （11）移液器转移澄清液至一新EP管。
纯化步骤
6 优点
这种磁珠分离DNA的方法避免了一般柱纯化离心、过滤等麻烦步骤，实现了核酸的快速分离，尤为重要的是其为实现自动化提供了依据。
另外QIAquick PCR Purification Kit 250kit装纯化试剂盒价格大概为3000元，平均至每一纯化柱价格为12元。而Agencourt ampure beads 450ml装磁珠价格大概为20000元，其可纯化超过3000个样品，平均每个样品的价格不到7元。相比之下，磁珠纯化成本大概为柱纯化的一半，因此实现磁珠纯化可大大降低成本。